DDPCR

實驗概要

高等生物體內一般有10⁵個基因，在這些基因中通常只有不到15％的基因得以表達，并且在生命代謝的不同階段，在不同的環境條件下有不同的基因表達，基因表達差異性是生物體性狀多樣性，適應能力多樣性的物質基礎。對同一品種在不同環境條件下的基因差異表達研究，可以了解基因與性狀間的關系，并進一步確定一些特殊的基因，dd－PCR技術是進年來發展起來的基因差異表達研究的手段之一。該技術利用mRNA3’端具有poly(A)的特點，以T12G、T12C、T12A為3’端引物擴增出cDNA；以10－mer的隨機引物為5’引物進行PCR擴增，mRNA不同，隨機引物結合位點不同，擴增后的條帶長度也不同，通過測序膠電泳即可將差異表達的mRNA找出，進一步通過克隆或作為探針進行雜交即可獲得差異基因。

主要試劑

T12G、T12C、T12A、10－mer的隨機引物、RT－PCR試劑盒、測序膠、銀染系統

主要設備

PCR儀、電泳儀、測序槽、銀染設備

實驗步驟

1. 總RNA提取(略)

2. 殘留DNA的去除

反應體系

          1－5ugRNA

          10×DNA酶緩沖液   2ul

          RNA酶抑制劑       1ul

          無RNA酶的DNase   1u

          加DEPC水   至    20ul

混勻，37℃ 15min 等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次，0.3V3M乙酸鈉，2V無水乙醇沉淀，冷凍干燥

3. RT    5×RT緩沖液     4ul

         0.2ug總RNA

         10umT12N        1ul

         加DEPC水 至   10ul

     80℃ 1min  42℃ 5min  再加入

         10mMdNTP                2ul

        100mMDTT                 1ul

         50nMMgCl₂              1.3ul

         RNA酶抑制劑(40u/ul)     1ul   

         MMLV(200u/ul)           1ul

         加DEPC水至            20ul

        37℃  1小時， 90℃ 1min

4. PCR  上述RT液               4ul

        10×PCR緩沖液          1ul

        25mM MgCl₂              1ul           94℃    1min

        10mMdNTP              0.4ul           94℃   30’

        dT12M                 0.2ul           40℃   30’     40循環

        10mer隨機引物         0.2ul           72℃   45’

        水                    3.9ul           72℃    6min

        Taq酶（5u/ul）       0.1ul

     混勻后，離心，再加上10ul石蠟油，按右邊參數擴增。

5. 檢測 齦染檢測(略)

6. 差異帶切割、回收操作(略)

7.  回收差異帶二次擴增

       回收的差異帶稀釋    50－100倍

        10×PCR緩沖液          1ul

        25mM MgCl₂              1ul       94℃    1min    94℃   45’

        10mMdNTP              0.4ul       94℃   45’      42℃   45’

        dT12M                 0.2ul       40℃   45’      72℃   60’

        10mer隨機引物         0.2ul      72℃   60’        20循環

        加水至                10ul        20循環        72℃   6min

        Taq酶（5u/ul）       0.1ul

8. PCR片斷的再回收和克窿操作(略)