DNA為本：熊巍團隊通過在體基因編輯治療遺傳性耳聾

　　北京腦科學與類腦研究中心（CIBR）熊巍實驗室在 Cell 子刊 Cell Reports 上發表了題為：Template-independent genome editing in the Pcdh15 av-3j mouse, a model of human DFNB23 nonsyndromic deafness（不依賴于修復模板的基因編輯應用于Pcdh15av-3j小鼠品系，一個人類非綜合性耳聾DFNB23的動物模型）。

　　首次在哺乳動物模型上展示了利用非同源末端連接（NHEJ）的基因修復通路有效實現先天性遺傳疾病的在體基因治療。

　　DNA水平基因修復成為下一代基因治療新方向

　　基因治療是治療基因突變導致的遺傳性疾病的金鑰匙，目前大部分工作集中在針對mRNA的基因替代（Gene replacement）或者基因沉默（Gene silence），若干適用性好的靶基因已經被用于臨床，體現出基因治療的可行性。然而就中心法則而言，在mRNA水平的修復還是治標不治本，因此針對DNA的基因修復代表了下一代基因治療的新方向，本研究提出特別針對DNA移碼突變的一個方案，并系統展示了在耳蝸毛細胞DNA水平的基因編輯有效恢復動物聽覺。

　　DNA水平的基因修復是以CRISPR-Cas為代表的基因編輯技術來實現，隨著2011年CRISPR-Cas工具的開發成熟，研究者可以依賴guide RNA（gRNA）實現穩定可控的定點DNA雙鏈切割/斷裂（DSB），CRISPR-Cas技術的一個重要應用就是實現定點切除致病突變。DSB的修復有諸多通路，其中最主要的是NHEJ和同源重組修復（HDR）兩種：NHEJ產物攜帶各種插入或者缺失（InDel）導致的移碼突變，其結果等同于從一個突變到多種突變，因此沒有得到基因治療的很好應用；依賴HDR修復通路將靶基因修復為野生型，但是這一過程需要有一個野生型的DNA模板，然而在體情況下基于HDR通路的修復效率在活體動物的終端分化細胞上效率非常低，從一定程度上限制了基因編輯在基因治療上的應用。因此基于基因編輯技術的在體基因治療方案一直處于實驗室和細胞系體系研究階段。

　　首次在哺乳動物模型上展示了利用NHEJ基因修復通路實現先天性遺傳疾病的在體基因治療

　　自2016年以來，陸續有基于細胞系的研究表明gRNA-spCas9酶切割產生的DSB的末端連接產物并非隨機，而是可以預測和重復實現的，那么基于這一原理，對于某一個gRNA所獲得DNA編輯事件可以預測，反過來說可以根據DNA產物需要來選擇gRNA。然而這一規律在體內的實際情況是怎么樣的并不知道，該研究即利用小鼠耳蝸培養組織驗證了終端分化的功能細胞上編輯產物也具有可重復性，并利用該原理實現了單個gRNA即可修復移碼突變，實現小鼠的在體基因治療。

　　本研究展示了接收聲音振動的聽覺毛細胞可以利用內源性DNA修復通路中的最主要方式NHEJ（大于90%）修復InDel導致的移碼突變，在遺傳性耳聾動物模型（Pcdh15av-3j小鼠，攜帶一個腺苷的插入突變）上實現了導入單個gRNA有效修復該插入導致的遺傳性耳聾，而PCDH15蛋白是毛細胞tip link的組分，是毛細胞機械轉導通道開放的關鍵蛋白，蛋白質量有215kD之巨。該概念的成功驗證提示占人類22%的移碼突變導致的遺傳性疾病有廣闊的治療前景。

　　從體外組織和在體動物兩個層面展示通過NHEJ通路實現移碼突變的修復以及聽覺和平衡覺功能的部分修復

　　熊巍實驗室長期研究耳聾相關基因的生理和病理機制，本工作利用一株模擬人類DFNB23遺傳性耳聾的Pcdh15av-3j小鼠品系，全方位系統的展示了突變位點附近產生的DSB可以通過NHEJ通路實現移碼突變的修復以及聽覺和平衡覺功能的部分修復。本研究在體外組織和在體動物兩個層面，從編輯基因產物、蛋白表達、毛細胞功能、以及動物生理功能等多個角度的分析和評估來展現該方案的可行性。

　　組織層面：

　　耳蝸毛細胞的基因遞送一直是一個難點，熊巍博士早前開發了一套耳蝸組織培養和基因電轉遞送的系統解決方案（Xiong et al., Nat. Protoc. 2014），實現在培養的耳蝸組織上通過電轉（較大規模）向毛細胞導入外源基因，后續通過電生理或者鈣成像研究特定基因干預后的毛細胞功能變化。基于該耳蝸電轉技術，熊巍實驗室首先掃描了av-3j突變（1bp插入）上下游15bp的區域內的4條gRNA所產生的編輯產物，發現其中的m-3j-gRNA1表現出高比例的1bp刪除的編輯產物，而且重復性很高，意味著m-3j-gRNA1是一個潛在的治療av-3j突變的備選gRNA。在培養的Pcdh15av-3j耳蝸組織上，通過電轉表達了spCas9和m-3j-gRNA1的Pcdh15av-3j毛細胞可以恢復PCDH15蛋白的表達（Pcdh15av-3j突變導致PCDH15不表達上膜），同時Pcdh15av-3j毛細胞的機械轉導功能也有所恢復。有意思的是，在包括-1bp、-4bp、+2bp等在內的回碼（frame-restored）產物類別中，其最高占比產物均對PCDH15功能有明顯恢復，提示蛋白修復產物在非保守區即使1-2氨基酸的插入或者刪除并非絕對無功能，從轉化角度考慮也是值得去開發的一種可能性。

　　在體層面：

　　根據體外研究的效果，熊巍實驗室進一步對Pcdh15av-3j小鼠在體耳蝸注射包裹有m-3j-gRNA1的AAV2/9。通過對電轉耳蝸組織（體外）和病毒注射耳蝸組織（在體）的基因編輯產物進行的系統比對，發現它們無論是在主編輯產物還是產物的比例上均非常一致。進一步的對m-3j-gRNA1病毒注射小鼠的各方面指標的評估，包括耳蝸毛細胞的PCDH15表達（蛋白表達）、耳蝸毛細胞的機械轉導電流（細胞功能）、小鼠的聽性腦干電位（ABR，聽覺生理）和驚嚇反應（Startle，行為學）等，均顯示單個m-3j-gRNA1在spCas9的幫助下即可實現av3j突變的功能性恢復。熊巍實驗室同時也檢驗了前庭器官的恢復效果，結果顯示Pcdh15av-3j小鼠在注射m-3j-gRNA1后也得到了平衡功能的恢復。

　　為基于基因編輯技術的在體基因治療提供進一步支持

　　基因藥是繼化學藥之后的基礎和臨床各機構研發的下一代藥物的重點方向，在人體基因遞送和基因表達等技術門檻陸續解決的情況下，遺傳性疾病的基因治療的前景越來越明確。2012年CRISPR-Cas技術的橫空出世，提供了有效且實用的DNA編輯工具，讓面向DNA的在體基因治療成為可能。化學藥和基因替代/沉默等手段通常只能做到治標不治本，而面向DNA的基因編輯帶來的基因修復，可以讓被修復基因跟隨生命體的生長節奏在時間上和空間上實現內源表達調控，是最自然的基因表達和調控的體現，也應該是最理想的針對遺傳性疾病的修復方式。

　　研究歷程

　　熊巍實驗室在2015年建立實驗室之時即確立了研究遺傳性耳聾基因治療的方向，所有的技術和資源都是從零開始積累，期間嘗試了多種策略和方法，最終鎖定利用到NHEJ的非隨機修復機制來重塑移碼突變導致的致聾突變。本工作從2019年底投稿到2022年上半年最終接收，歷時2年半，不可謂不艱難，不過“凡是過去，皆為序章”！

　　該論文的共同第一作者為劉戀、鄒林志和李寬三位博士研究生，本工作也得到南方科技大學陳放怡實驗室、山東大學徐志剛實驗室和清華大學孫前文實驗室的大力協助，論文通訊作者為熊巍。