2．第二代分子標記
2.1 SSR標記技術
在真核生物基因組中存在許多非編碼的重復序列，如重復單位長度在15～65個核苷酸的小衛星DNA(Minisatellite DNA)，重復單位長度在2～6個核苷酸的微衛星DNA(Microsatellite DNA)。小衛星和微衛星DNA分布于整個基因組的不同位點。由于重復單位的大小和序列不同以及拷貝數不同，從而構成豐富的長度多態性。Moore等于1991年結合PCR技術創立了SSR(Simple sequence repeat，簡單重復序列)標記技術。SSR也稱微衛星DNA，是一類由幾個(多為1～5個)堿基組成的基序串聯重復而成的DNA序列，其中最常見的是雙核苷酸重復，即(CA)n和(TG)n ，每個微衛星DNA的核心序列結構相同，重復單位數目10～60個，其高度多態性主要來源于串聯數目的不同。不同遺傳材料重復次數不同，導致了SSR 長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標記產生的基礎。SSR標記的基本原理是根據微衛星重復序列兩端的特定短序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段。由于核心序列重復數目不同，因而擴增出不同長度的PCR產物，這是檢測DNA多態性的一種有效方法。微衛星序列在群體中通常具有很高的多態性，而且一般為共顯性，因此是一類很好的分子標記。
2.2 ISSR 標記技術
ISSR即內部簡單重復序列，是一種新興的分子標記技術。1994年Zietkiewicz等對SSR技術進行了發展，建立了加錨微衛星寡核苷(Anchored-microsatellite-oligonucleotides)技術[14]。他們用加錨定的微衛星寡核苷酸作引物，即在SSR的5′端或3′端加上2～4個隨機選擇的核苷酸，這可引起特定位點退火，從而導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間的基因組節段進行PCR擴增。這類標記又被稱為ISSR(Inter simple sequence repeat)、ASSR(Anchored simple sequence repeats)[15]或AMP PCR[16]。在所用的兩翼引物中，可以一個是ASSR引物，另一個是隨機引物。如果一個是5′端加錨的ASSR引物，另一個是隨機引物，則被稱為RAMP技術[17]。
3.第三代分子標記
3.1 SNP標記技術
單核苷酸多態性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)被稱為第3代DNA分子標記，是指同一位點的不同等位基因之間個別核苷酸的差異，這種差異包括單個堿基的缺失或插入[18]，更常見的是單個核苷酸的替換，且常發生在嘌呤堿基(A與G)和嘧啶堿基(C與T)之間。SNP標記可幫助區分兩個個體遺傳物質的差異，被認為是應用前景最好的遺傳標記。目前，已有2000多個標記定位于人類染色體上，在擬南芥上也已發展出236個SNP標記。在這些SNP 標記中大約有30%包含限制性位點的多態性。檢測SNP的最佳方法是DNA芯片技術，最新報道的微芯片電泳(Microchip electrophoresis)，可以高速度地檢測臨床樣品的SNP，它比毛細管電泳和板電泳的速度可分別提高10 和50倍[19]。SNP與第1代的RFLP及第2代的SSR標記的不同有2個方面:其一，SNP不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標記;其二，SNP標記分析完全摒棄了經典的凝膠電泳，代之以最新的DNA芯片技術。
3.2 EST標記技術
表達序列標簽(Expressed sequence Tag ，EST)是美國國立衛生研(National Institutes of Health ，NIH)的生物學家Venter于1991年提出的[20]。隨著人類基因組計劃的開展，EST技術首先被廣泛應用于尋找人類新基因，繪制人類基因組圖譜，識別基因組序列編碼區等研究領域，之后又被廣泛應用于植物基因組研究[21]。EST是指在來源于不同組織的cDNA文庫中隨機挑選克隆、測序，得到部分cDNA序列，一個EST對應于某一種mRNA的cDNA克隆的一段序列，長度一般為150～500bp，只含有基因編碼區域。EST可代表生物體某種組織某一時間的一個表達基因，所以被稱之為“表達序列標鑒”;而EST的數目則顯示出其代表的基因表達的拷貝數，一個基因的表達次數越多，其相應的cDNA克隆越多，所以通過對cDNA克隆的測序分析可以了解基因的表達豐度[22]。目前構建cDNA文庫一般都使用試劑盒，方法成熟，而且飛速發展的DNA測序技術，也使得進一步降低大規模DNA序列測定成本成為可能[23]。
4．幾種新型分子標記
4.1 RGAs標記(Resistance Gene Analogs，抗病基因類似物)
RGAs是用基于抗病基因保守序列設計的引物擴增基因組得到的抗病基因類似序列的新型的分子標記。盡管基因間整個序列的同源性不足于用RFL P 雜交檢測，但抗病基因中存在的這些保守區域為在其它植物中進行PCR 擴增和分離RGAs 提供了機會[24]。
4.2 RMAPD 標記(random microsatellite amp lify polymorp hic DNA ，隨機微衛星擴增多態)
利用RAPD引物和微衛星上游或下游引物結合，對基因組DNA 進行擴增，探索更有效的揭示所有微衛星及其他DNA遺傳多態性的方法，以期獲得研究DNA多態性的新的分子標記方法。因該方法同時利用隨機引物和微衛星引物進行擴增，暫時定名為隨機微衛星擴增多態DNA[25]。
4.3 SRAP(Sequence Related Amplified Polymorp hism ，相關序列擴增多態性)
SRAP標記是基于PCR技術的新型分子標記技術，其原理是利用基因外顯子里G、C 含量豐富，而啟動子和內含子里A、T含量豐富的特點設計兩套引物，對開放閱讀框架進行擴增。此技術具有簡便、穩定、中等產率和容易得到選擇條帶序列的特點，在基因組中分布均勻，適合于不同作物的基因定位、基因克隆和遺傳圖譜構建[26]。
4.4 TRAP 標記( Target Region Amplified Poly morp hism ，靶位區域擴增多態性)
TRAP是由HUJ G等于2003年從SRAP技術改進而來的新型分子標記技術，其原理是借助大規模測序技術產生的龐大生物序列信息，利用生物信息學工具和表達序列標簽數據庫信息設計引物，對目標候選基因序列區進行PCR擴增產生多態性標記。此標記具有操作簡單、重復性好、穩定性好、效率高的特點。目前已經成功應用于許多植物的遺傳圖譜構建、重要性狀基因標記、種質資源的多樣性研究及分子標記輔助育種等方面[26]。
參考文獻：
[1] 傅榮昭, 邵鵬柱, 高文遠. DNA分子標記技術及其在藥用植物研究上的應用前景[J] . 生物工程進展, 1998, 18(4): 14～161.
[2] 朱玉賢, 李毅. 現代分子生物學[M] . 2版. 北京: 高等教育出版社, 2002.
[3] 周延清. DNA分子標記技術在植物研究中的應用[M] . 北京: 化學工業出版社, 2005: 56-57.
[4] WILLIAMS JCK, KUBELIKAR, LIVAK KJ. DNA polymorphism amplified by
arbitrary primers are useful genetic markers[J] . Nucleic Acids Res , 1990 , 18 : 6531–6537.
[5] 滕兆巖. 星星草RAPD2PCR反應體系建立與優化[J] . 生物技術, 2007, 17(1): 48 -49.
[6] 王志林, 趙樹進, 吳新榮. 分子標記技術及其進展[J] . 生命的化學, 2001, 21(1): 39–42
[7] 楊慧珍. RAPD標記在林木育種中的應用[J] . 山西農業科學, 2007, 35(1): 73- 76.
[8] 趙淑清, 武維華. DNA分子標記和基因定位[J] . 生物技術通報, 2000(6): 1-2.
[9] VELAPPAM N, SONDRASS J L , HAKOVIRTA J R. Rapid identification of
pathgenoic bacteria by single2enzyme amplified fragment length polymorphism analysis[J] . Diagnostic Microbiology and Infections Disease , 2001, 39: 77-83.
[10] 熊立仲, 王石平, 劉克德, 等. 微衛星和AFLP 標記在水稻分子標記連
鎖圖上的分布[J] . 植物學報, 1998, 40(7): 605-614.
[11] OTSEN M, BIEMAN M D. Amplified fragment length polymorphisms used for
the genetic characterization of rat inbred stains[C]. Proceedings 24th Interna2 tional Society for Animal Genetics. [s. l. ] : [s. n] , 1994.
[12] 祝軍. 蘋果M系矮化砧木AFLP指紋圖譜的構建與分析[J] . 農業生物技術學報, 2000(1): 59-62.
[13] 黎裕, 賈繼增, 王天宇. 分子標記的種類及其發展[J] . 生物技術通報,
1999, 15(4): 19-22.
[14] ZIETKIEWICZ E, RAFALSKI A, LABUDA D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)2anchored polymerase chain reaction amplification[J] . Genomics, 1994, 20(2): 176-183.
[15] WANG G, MAHALINGAM R, KNAP H T. (C2A) and (G2A) anchored simple
sequence repeats (ASSRs) generated polymorphism in soybean , Glycine max
(L. ) Merr[J] . Theor Appl Genet, 1998, 96: 1086-1096.
[16] WEISING K, WINTR P , HüTTEL B , et al. Microsatellite markers for molecular. breeding[J] . J Crop Prod, 1998, 1: 113–143.
[17] WU KS, JONES R, DANNEBERGERL, etal. Detection of microsatellite poly2
morphisms without cloning [J ] . Nucleic Acids Res , 1994, 22: 3257-3258.
[18] CHO RJ, MINDRINOSM, RICHARDS D R, etal. Genome2wide mapping with
biallelic markers in Arabidopsis thaliana[J] . Nature Genetics, 1999, 23: 203-207.
[19] SCHMALZING D, BELENKY A, NOVOTNY M A, et al. Microchip elec
trophoresis : a method for high2speod SNP detection [J] . Nucleic Acids Res, 2000, 28(9): 43.
[20] ADAMSMD, KELLEYJ M, GOCAYNE J D, et al. Complementary DNA sequ-
Encing: expressed sequence tags and human genome project [J] . Science , 1991, 252(5013): 1651-1656.
[21] 駱蒙, 賈繼增. 國際麥類基因組EST計劃研究進展[J] . 中國農業科學,
2000, 33(6): 110-112.
[22] 駱蒙, 賈繼增. 植物基因組表達序列標簽(EST)計劃研究進展[J] . 生物化學與生物物理進展, 2001, 28(4): 494-497.
[23] 李紅, 盧孟柱, 蔣湘寧. 表達序列標簽(EST)分析及其在林木研究中的應用[J] . 林業科學研究, 2004, 17(6): 804-809.
[24] 鐘鳴, 牛永春. DNA分子標記技術在小麥抗銹病基因研究中的應用[J] . 植物保護, 2000(2): 32-35.
[25] 藍賢勇, 陳宏, 張永德, 等. 一種新的分子標記方法—隨機微衛星擴增多態DNA(RMAPD)[J] . 遺傳, 2006, 28(1): 78-84.
[26] 邊銀丙, 宋小亞. 幾種新型DNA分子標記及其在食用菌研究中的應用[J] . 食用菌學報, 2006, 13(1): 73-81.