DNA雙鏈斷裂檢測——變壓場凝膠電泳（GFGE）

DNA雙鏈斷裂與細胞死亡的關系更為密切。變壓場凝膠電泳是采用將細胞包埋在低熔點瓊脂糖凝膠中，通過蛋白酶、去污劑等滲入凝膠中融解細胞、去蛋白，純化細胞DNA，再通過梯增電壓進行瓊脂糖凝膠電泳，結合DNA解旋熒光測定（FADU）法和檢測DNA雙鏈斷裂。

1、主要試劑及配制方法：
（1）蛋白酶K，SDS，低熔點瓊脂糖。
（2）配制方法：
細胞緩沖液（A液）。0.25mol/L NaCl + 10mmol Na2HPO4 + 1mmol/L MgCl2，pH7.2.
細胞裂解液（B液）。9mol/L脲 + 10mmol/L NaOH + 2.5mmol/L環烷二胺四乙酸 + 0.1%SDS。
堿性變性液I（C液）。B液 + 0.2mol/NaOH，體積比為45：55.
堿性變性液I（D液）。B液 + 0.2mol/NaOH，體積比為40：60.
抗變性液（F液）。1ug/L溴化乙錠 + 13.3mmol/NaOH.

2、實驗操作步驟：

（1）DNA雙鏈斷裂的FADU測定：
分別取對照組和處理過的細胞2 x 10^5個加入試管內，對照管設T管（未變形）、B管(空白)、P管（部分變性）3組，處理過的細胞僅設Pi組，每組3個平行樣品，，各加0.2ml細胞裂解液，0℃裂解細胞10min。
細胞裂解后，T管加E液（抗變性液）0.4ml，其他各管沿管壁緩慢加入0.1mlC液和0.1mlD液，不混勻，置0℃避光30min。
B管超聲處理20s置15℃ 45min。
降為0℃后，P管、B管加E液0.4ml，混勻后T管、P管超聲處理5s。
各加入F液1ml，混勻后，室溫下用熒光分光光度計測量相對熒光強度（激發光520nm，發射光590nm）。
結果計算。

（2）DNA雙鏈斷裂的GVGE測定：
細胞DAN準備。收集細胞，用PBS洗滌并懸浮，調整細胞濃度為1 x 10^7個/ml，與等體積1.2%低熔點瓊脂糖混合后制成小塊，細胞膠塊懸于含有不同濃度處理因素的培養基中，37℃孵育15-30min后將細胞膠塊置于2mg/ml蛋白酶K、1%SDS、0.5mol/LEDTA、10mmol/L Tris-HCl的裂解液中，50℃，24h，融解細胞，去蛋白。然后用TE緩沖液清洗膠塊，置于0.5mol/L EDTA中4℃保存待電泳。
電泳。電泳凝膠為0.9%瓊脂糖，膠塊大小10cm x 11.5cm x 1cm。取上述制備的DNA樣品膠塊放入電泳凝膠的加樣孔中，用0.9%瓊脂糖封固以防氣泡，置于含45mmol/ Tris-硼酸、1.25mmol/L EDTA，pH8.0的電泳緩沖液中，逐漸升高電壓，0.6V/cm x 40h，1.5V/cm X 7h，3.0V/cm x 2.5h，電泳完畢，取出凝膠。
照相圖像分析。將上述凝膠在紫外燈下照射，同時，凝膠塊用圖像儀進行分析，顯示樣品DNA進膠盒殘留在原點的分布狀況，浸入凝膠的DNA即為雙鏈斷裂DNA。