DNA序列分析技術2

3)電泳
電極緩沖液 1 倍TBE（pH 值8.0）
預電泳 30 分鐘至1 小時
恒溫方式 測序膠板上夾蓋鋁恒溫板
電泳溫度 50℃左右
電泳條件 恒功率 90～110W
電泳時間 2.5 小時至5 小時

4)干膠制備和壓片
電泳結束后取下膠板，用工具撬開玻璃板，使膠留在其中一塊板上。將裁剪好的新華3 號濾紙在膠上貼緊，使膠粘在濾紙上，然后將膠放置于干膠器中制備干膠1～1.5 小時。制好的干膠放入壓片盒中，放于暗室中，將X 光片壓于膠上曝光2～3 天。

5)X 光片的沖洗
將曝光后的X 光片顯影4～8 分鐘（根據顯影液的使用時間長短而定）；定影5～10 分鐘，沖洗后即可讀取DNA 序列。

3.自動DNA 序列分析技術
本節描述運用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自動DNA 測序儀進行雙鏈DNA 測序的方法。熱循環測序反應使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit（＃401434）或FS-DNA Sequencing Kit（＃402079）進行。操作過程主要根據廠家推薦的方法進行。具體操作方法如下。

1)混合反應物
（1）取2.5μl 純化好的PCR 產物［相對于2.5μl 測序試劑盒中的pGEM-3Zf（＋）DNA］，進行瓊脂糖凝膠電泳。
（2）凝膠用溴化乙錠染色，用流水沖洗脫色后，在紫外光下進行照相記錄。參照pGEM-3Zf（十）DNA 估測待測DNA 模板的濃度，以確定測序反應中應取的模板量。
（3）在一個標記的 0.5ml Eppendorf 管中，混合以下反應物：
DNA 模板 適量
引物（10pmol／ml） 0.5μl
加水至 5.25μl 或6.0μl（FSKit）
100℃下變性2 分鐘，再冰浴2 分鐘后短暫離心，然后加：
DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit 中測序液 4.75μl
或 FS-DNA Sequencing Kit 中測序液 4.0μl
終體積 10μl
（4）用微量取樣器將反應物充分混合后，加 20μl 石蠟油覆蓋。

2)熱循環反應
該反應中降溫時間非常關鍵（約1℃／s）。因此，可使用Perkin-Elmer 序列的熱循環儀（PCR 儀，如 480，2400 或 9600）。以下所描述的操作均基于Perkin-Elmer Model 480 熱循環儀。將反應管放入熱循環儀中，按以下程序進行熱循環反應：
（1）96℃ 1 秒鐘
96℃ 30 秒鐘
（2）50℃ 1 秒鐘
50℃ 1 分鐘
（3）60℃ l 秒鐘
60℃ 4 分鐘
共需25 個循環。
3)純化測序產物
純化測序產物最好的方法是使用Princeton Separations Inc 的Centri SeP 柱（＃CS-901）。操作過程如下：
（1）輕彈柱，使Cephadex G-50 膠粉從柱底部揚起。
（2）移去柱上蓋，加入 800μl 去離子水，再蓋上蓋振蕩，以除去氣泡。
（3）在室溫下放置30 分鐘，以水化凝膠柱。
（4）移去柱上蓋和下蓋，將凝膠柱放入一個配置好的洗脫管中，讓多余液體流出。
（5）倒去液體，將柱連同洗脫管一起在 3 000r／min 下離心 2 分鐘。
（6）將柱放入一個1.5ml 離心管中，用微量取樣器將測序反應物取出，注在凝膠柱中央。注意避免帶入石蠟油。
（7）3 000r／min 下離心 2 分鐘。應注意柱的定向必須與第一次離心時一致。
（8）將樣品放在真空干燥離心機中干燥。
（9）將干燥后的樣品貯存于—70℃下待進行電泳。在此條件下保存1 年之久的樣品其熒光也不會猝滅。
應注意的是，Centri-sep 柱體可反復使用多次。每次使用過后，要用自來水洗3 次，蒸餾水洗 2 次，然后倒置于一試管架上晾干后，稱取 50mg Cephadex G-50（Sigma，＃9048719）放入其中，即可再行使用。
4)電泳
使用ABI 公司的377 型全自動DNA 序列分析儀電泳，并記錄序列數據。控制軟件為PRIM377 Collection。電泳過程如下。
（1）聚丙烯酚胺凝膠濃度為4.25％，配制過程如下：
尿素 18g
Amberlite 離子交換樹脂（Sigma，MB-lA） 約39g
40％Acry mide：Bis（19:1 ）（AMRESCO，＃0496-500） 5.3ml
去離子水 25ml
將混合液在電磁攪拌器上攪拌10 分鐘。
（2）取5ml 10 倍TBE，通過2μm 濾膜抽濾后，再抽濾以上膠液。
10 倍TBE 配方：
Tris-base 108g
硼酸 55g
Na2 EDTA（2H2O） 7.44g
定容至 1L
（3）將濾過液定容至 50ml，加入 35μl TEMED 和 250μl 10％過硫酸胺（APS），輕搖混合后，用50ml 無針頭注射器將膠注入已裝配好的玻璃板中。
（4）1 小時后，將膠安裝于全自動序列儀上預電泳 30 分鐘，恒壓1kv，并使溫度升至 51℃。
（5）預電泳的同時，取出 36 份—70℃下貯存的樣品，各加入5μl 載樣液（50μl 試劑盒中配備的loading buffer＋250μl 去離子甲酰胺，臨用前配制）。
（6）將混合液在旋渦混合器上振蕩，94℃下變性2 分鐘，冰浴2 分鐘后短暫離心。
（7）各取 1.5μl 點樣，恒壓 1.68kv 電泳 7 小時。機器將自動分析和記錄序列結果。常有電泳道識別錯誤的情況，此時應人為修復。