二、Maxam－Gilbert DNA 化學降解法
與包括合成反應的鏈終止技術不同，Maxam-Gilbert法要對原DNA
進行化學降解。這一方法是在體外研究lac阻抑制與lac操縱基因相互作用時醞釀發展起來的。時至今日，可以探測DNA 構象的蛋白質－DNA
相到作用，仍然是Maxam- Gilbert法獨具的鮮明特點。在這一方法（Maxam和Gilbert，1980）中，一個末端標記的DNA
片段在5組互相獨立的的化學反應分別得到部分降解，其中每一組反應特異地針對某于種或某一類堿基。因此生成5組放射性標記的分子，從共同起點（放射性標記末端）延續到發生化學降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA
分子，其長度取決于該組反應所針對的堿基在原DNA
全片段上的位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。相對而言，Maxam-Gilbert法自初次提出以來，基本沒有變化。雖然設計了另一些化學降解反應（見綜述：Ambrose和Pless，1987），但這些反應一般只作為Maxam和
Gilbert(1977，1980)最早提出的反應的補充。這一方法的成敗，完全取決于上述這些佞兩步進行的降解反應的特異性。第一步先對特定堿基（或特定類型的堿基）進行化學修飾，而第二步修飾堿基從糖環上脫落，修飾堿基5'和3'的磷酸二酯鏈斷裂。在每種情況下，這些反應都要在精心控制的條件下進行，以確保每一個DNA
分子平均只有一個靶堿基被修飾。隨后用哌啶裂解修飾堿基的5'和3'位置，得到一組長度從一到數百個核苷酸不等的末端標記分子。比較G、A＋G、C＋T、
C和A>C各個泳道， 右從測序凝膠的放射自顯影片上讀出DNA 序列。由于種種原因（如采用32P進行放射性標記、末端標記DNA
的比活度、裂解位點的統計學分布、凝膠技術方面的局限性等等），Maxam-Gilber法所能測定的長充要比Sanger法短一些，它對放射性標記末端
250個核苷酸以內的DNA
序列效果最佳。在70年代Maxam-Gilbert法和Sanger法剛剛問世時，利用化學降解進行測序不但重現性更高，而且也容易為普通研究人員所掌握。Sanger
法南非要單鏈模板和特異寡核苷酸的，并需獲得大腸桿菌DNA 聚合酶IKlenow
片段的高質量酶制劑，而Maxam-Gilbert法只需要人所共的簡單化學試劑。但隨著M13
噬菌體和噬菌粒載體的發展，也由于現成的合成引物唾手可得及測序反應日臻完善，雙脫氧鏈終止法如今遠比Maxam-Gilbert法應用得廣泛。然而，化學降解較之鏈終止法具有一個明顯的優點：所測序列來自原DNA
分子而不是酶促合成所產生的拷貝。因此，利用Maxam-Gilbert法可對合成的寡核苷酸進行測序，可以分析諸如甲基化等DNA
修飾的情況，不可以通過化學保護及修飾干擾實驗來研究DNA 二級結構及蛋白質與DNA
的相互作用。然而，由于Sanger法既簡便又快速，因此是現今的最佳選擇方案。事實上，目前大多數測序策略都是為Sanger法而設計的。
類核苷酸類惟物的耐受性看來也優于原來的測序酶。
三、測序策略
確證性測序
從頭測序
開始測序之前，必須根據待測序列區的長度，所要求的測序精確度以現有有設施來制定測序總策略。只有一小部分的研究劃需需分從頭測定大段從測定過和序列，而列多的情況是通過測序對突變（如點突變和缺失）進行定位和鑒定，并證實構建的重組DNA
的方向與結構。用于上述兩種目的的方略大不相同。
（一）確證性測序
確證性測序（例如對利用寡核苷酸倡導的誘變而產生的突變體進行測序）往往只需要僅僅一套反應，以取得雙鏈DNA
其中一條鏈上局部區域的核苷酸序列，通常只須對亞克隆于M13噬菌體或噬菌粒載體上的一段合適的限制酶切片段進行測序，即可如原以償。在許多情況下，等測區落于通用引物的測序范圍之內；若不然，最好的方法就是合成一段長度為17-19核苷酸的寡核苷酸引物，與距離待測區約50-100核苷酸的序列互補。只要可能，應同時測定野生型基因上同源區的序列和突變的相應序列。直接在同一張放射自顯影片上對照有關序列，極有助于確證變異區序列并將使突變體與野生型基因之間任何出乎意料之外的其他差異一目了然。
（二）從頭測序
從頭測序的目的是要提供一段DNA 的準確核苷酸序列，這一區段可長達數千堿基，而其序列從來未經測定。由于單套測序反應所能準確測定的靶DNA
序列最長可達400堿基左右，因引進行從頭側序必須經過精心策劃。長約400堿基的枝DNA
可以按互為相反的方向分別克隆于2種M13噬菌體載體（如M13mp18 和13mp
119）上。然后每條鏈的全序列可以通過利用通用測序引物進行的單套反應得以測定。如果要對更長的靶DNA
（如長達數千堿基）進行測序，則可在兩種通用策略中一而行：
（1）隨機法（或鳥槍測序法） 在隨機法中，序列資料是從含有靶DNA 隨機片段的亞克隆中收集而來的。既不須努力確定這些亞克隆在靶DNA
中的位置，也不必設法查明究竟測出的是哪一條鏈的序列，只要把積累資料貯存起來，最后可用計算機排列妥當（Staden，1986）。這一方法是由劍橋的醫學研究委員會（M．R．C．）實驗室率推行的，曾經成功地用于測定人線粒體DNA
（Anderson 等，1981）、人腺病毒DNA （Gingeras等，1982;Roberts等，1986）、λ噬菌體DNA
（Sanger等，1982），以及Epstenin-Barr病毒DNA （Baer等， 1984）的序列。
（2）定向法 在定向法中，靶DNA 的測序按計劃有秩序地進行。例如，靶DNA
的全序列可以通過測定一系列嵌套的缺失突變體的序列而獲得，這些突變體具有相同的起點（通常在靶DNA
的一端）并分別穿入靶序列區縱深不同距離處，因此它們可以使靶DNA
中更遙不可及的區段漸進地落入可利用通用引物進行測序的范圍之中。另一種方法是，利用一套反應中取得的核苷酸序列設計新的寡核苷酸充當后續一套反應的引物，從而循序漸進地獲得從示測定過的靶DNA
片段的序列。因此在這一方法中。DNA 序列的積累是通過沿DNA
鏈漸進移動引物結合位點而實現的。盡管對隨機法與定向法的取舍通常由實驗室的物力與專長所決定，但仍有一少其他因素也會影響最終的抉擇，這些將在稍后加以討論