３．DNA 聚合酶
通常用于雙脫氧法序列測定的有幾種不同的酶，其中包括大腸桿菌DNA
聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反轉錄酶（見文獻，如Mieredorf和Prfeffer，1987）經過修飾消除了
3'→5'外節酶活性的T7噬菌體DNA
聚合酶（Sequenase）和測序酶2.0），Tabor和Richardson，1978]惟及從嗜熱水生菌（T'hermus
aquaticus）分離的耐熱DNA 聚合物（Taq DNA 聚合酶）。這些酶的特性差別懸殊，因而可大大影響通過鏈終止反應所獲得的DNA
序列的數量的質量。
（1）大腸桿菌DNA 聚合酶IKlenow 片段 這種酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然廣泛用于DNA 序列測定的酶。
通常碰到的兩個問題是：1）Koenow片段的持續合成能力低，以致一些片段并非由于dd
NTP的摻入，而是因為聚合酸人模板上隨機解離而終止合成，因而導致背景增高。由于該酶不能沿模板進行長中距離移動，因此利用該酶進行的標準測序反應所得序列的長度有限。通常，這一反應只能得到大約250-350個核苷酸的序列。
如果分兩步進行反應，所得序列的數目可以翻一番；其中第一步是初始標記步驟，采用低濃度的dNTP，而隨后的第二步是鏈延伸－鏈終止反應，含有ddNTP
和高濃度的dNTP（Johoston-Dow等，1987;Stambaugh和Blakesley，1988）。然而即使有了這些改進，用
Klenow
酶所測序列的長度通常還是不如持續合成能力較強的測序酶。2）這種酶對模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二級結構的區域進行復制的效能很低。將聚合反應的溫度提高到55℃，可以緩解但并不能徹底解決這一問題（Gomer和Firtel，1985)。有時可采用一些dNTP類似物[如dITP或7－脫氮
dGTP（7－deaza-dGTP）]來獲取模板中可形成穩定二級結構的相應區段的序列信息，但Kleow酶對這些類似物的作用不如測序酶有效，這也許是因為它們使Klenow酶原已較低的持續合成能力進一步降低。總而言這，可以選用大腸桿菌DNA
聚合酶IKlenow片段測定從引物5'位置起250個堿基以內的一段DNA 序列， 但不宜用它來測定更長一段DNA
序列或者具有二重對稱和（或）同聚核苷酸段的DNA 序列。
（2）反轉錄酶 盡管日常測序工作并不廣泛使用反轉錄酶，但有時用這個酶解決一些由于模板DNA
中存在A/T或G/C同聚核苷酸區而引起的問題。來自禽類和鼠類反轉錄病毒的反轉錄酶在這一看來要比Klenow酶略勝一籌（Karanthaansis，1982;Graham等,1986
）,盡管它們也許還是比測序酶遜色（Cameron-Mills，1988;Revak等1988）。
（3）測序酶: 測序酶（SequenaseTM）是一種經過化學修飾的T7噬菌體DNA
聚合酶。這酶原來具有很強的3'→5'外切核酸活性，經過修飾后， 這一活性大部分均被消除。測序酶2.0版是測序酶的基因工程產品，它完全缺失了3'
→5'外切核酸酶活性，極其穩定而經活性要比經化學修飾的測序酶高2倍。測序酶持續合成能力很強，聚合速率很高，對諸如dITP和7－脫氮－dGTP等用于提高分子辨率使測序凝膠某些區段上的壓縮條帶得以分開的核苷酸類似物具有廣泛的耐受性。它是測定長段DNA
序列的首選酶。測序酶可以沿模板移動很長的距離，因而一套反應常常就可以測定數百個核苷酸的DNA
序列。實際上，測得序列的長度更多是受聚丙烯酰胺凝膠的分辨能力而不是受該聚合酶的特性所制約。為了充分利用測序酶極高的持續合成能力，可采用兩步測序反應。第一步首先采用低濃度的dNTP的較低溫度，
以便將合成反應限制在適度之下并確保放射性標記dNTP和較低溫度，以便將合成反應限制在適度之下并確保放射性標記dNTP的有效摻入，這步反應的產物是僅僅延伸了20-30堿基的引物。
再將第一步反應等分于4組1套的標準反應系統中，每組反應中都含有高濃度的d
NTP和一種ddNTP。這樣聚合反應就得以繼續，直至造成鏈終止的核革酸摻入正在增長的鏈中。
（4）Taq DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶適用于測定在37 ℃形成大段穩定十級結構的單鏈DNA 模板序列。這是因為Taq DNA
聚合酶在70-75℃活性最高，這一溫度下即使GC豐富的模板也無法形成二級結構。按照1nnis 等（1988）介紹的方法使用Taq DNA
聚合酶進行測序，在放射自顯影片上得到的測序梯連續數百個堿基條帶始終清晰如一，表明這種酶的持續合成能力甚佳。模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。
４．放射性標記的dNTP
直至幾年以前，實際上所有DNA
測序反應都用[α－32P]dNTP來進行。然而32P發射的強β粒子造成兩個問題。首先由于發生散射，放射自顯影片上的條帶遠比凝膠上的DNA
條帶更寬、更為擴散，因此將影響到所讀取的序列（尤其是從放射自顯影片的上部所讀取的序列）的正確性并將制約從單一凝膠上能讀出的核苷酸序列的長度。其次
32P的衰變會引起樣品中DNA 的輻射分解，因此用32P進行標記的測序反應只能保存一兩天，否則DNA
將被嚴重破壞以至測序凝膠上模糊不清、真假莫辨。[35S]dATP的引入（Biggin等，1983）大大緩解了上述兩方面的矛盾。由于35S衰變產生較弱的β粒子，其散射有所減弱，凝膠和放射自顯影片之間在分辨率上相差無幾，因此可以從一套反應中確切測定數百核苷酸的DNA
序列。此外，35S的低能輻射所引起的樣品分解比較輕微，因此，測序反應可在－20℃保存至1周，而分辨率不見下降。這樣，職果聚丙烯酰胺凝膠方面了發生技術故障，只要對測序反應進行重分析即可。
５．dNTP類似物
二重對稱的DNA 區段（特別是GC含量高者）可以形成鏈內二級過程中不能充分變性。因此將引起不規則遷移，使鄰近的DNA
條帶壓縮在一起，以致難以讀出序列。這種壓縮現象歸因于DNA 二級結構的存在，而且不可能通過改變測序反應中出序列。這種壓縮現象歸因于DNA
二級結構地存在，而且不可能通過改變測序反應中所用DNA
聚合酶的種類而得到減輕。但是凝膠中的壓縮區段往往可以通過采用諸如dITP（2'－脫氧次黃苷15'
－三磷酸）或7－脫氮－dGTP（7－脫氮－2'－脫氧鳥苷－5'
－三磷酸）等核苷酸類似物進行分辨。這些類似物與普通堿基的配對能力較弱，而且是測序酶和Taq DNA 聚合酶等DNA
聚合酶的合適底物（Gough和Murray，1983;Mixusawa等，1986;Innis等，1988）。但對某些壓縮條帶，7－脫氮－dGTP無濟于事；同樣，dITP也無補于另一壓縮條帶（尤其是得于GC豐富區的縮條帶）的分辨。如果需要采用類似物，首先可試用dOTP，如果壓縮條帶用d
ITP或7－脫氮－dGTP都無法分辨， 則轉而測定另一條鏈的DNA 序列幾乎總能如愿以償。如上所述，兩種形式的測序酶和Taq DNA
聚合酶對核苷酸類似物的耐受性優于大腸桿菌DNA
聚合酶IKlenow片段。此外，制造廠商聲稱在測定含穩固二結構的模板序列時，測序酶2.0版要優于原來的測序酶。測序酶2.0版持續合成能力強于測序酶，其作用總是一氣呵成，很少半途而廢，因而消除了“鬼”帶。
而且，測序酶2.0版對諸如dITP類核苷酸類惟物的耐受性看來也優于原來的測序酶。