DNA拓撲異構酶能催化的反應很多，這里只能作簡單敘述。DNA拓撲異構酶I對單鏈DNA的親和力要比雙鏈高得多，這正是它識別負超螺旋DNA的分子基礎，因為負超螺旋DNA常常會有一定程度的單鏈區。負超螺旋越高，DNA拓撲異構酶I作用越快。現已知道，生物體內負超螺旋穩定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物體通過拓撲異構酶1和II的相反作用而使負超螺旋達到一個穩定狀態。現已發現，編碼E．coli拓撲異構酶I的基因topA發生突變，則會引起旋轉酶基因的代償性突變；否則，負超螺旋增高，細胞生活能力降低。拓撲異構酶I作用的堿基序列特異性不高，但切點一定在C的下游方向4個堿基(包括C本身)的位置。在將DNA單鏈切斷后，拓撲異構酶I連接于切口的5端，并貯藏了水解磷酸二脂鍵的能量用以連接切口，因而拓撲異構酶I的作用不需能量供應。此外．拓撲異構酶I還能促進兩個單鏈環的復性，其作用是解除復性過程所產生的鏈環數的負值壓力，以使復性過程進行到底。如果在一個單鏈環上一個部位切斷，而使另一部位繞過切口．則可產生三葉結結構分子 (trefoil knot)。如果有兩個雙鏈環，其中一個有一個切刻，拓撲異構酶1則可以將切刻對面的一條鏈切斷，使完整的雙鏈環套進去，再連接起來而成為環連體分子(catenane)。拓撲異構酶I還能催化其他反應，這將在復制和重組的機制中再講述。