一. 實驗目的
1. 掌握DNA指紋圖譜技術的概念、原理和基本操作過程
2. 學習DNA的限制性酶切的基本技術
3. 掌握瓊脂糖凝膠電泳的基本操作技術，學習利用瓊脂糖凝膠電泳測定DNA片段的長度，并能對實驗結果進行分析。
二. 實驗原理
1984年英國萊斯特大學的遺傳學家Jefferys及其合作者首次將分離的人源小衛星DNA用作基因探針，同人體核DNA的酶切片段雜交，獲得了由多個位點上的等位基因組成的長度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋極少有兩個人完全相同，故稱為"DNA指紋"，意思是它同人的指紋一樣是每個人所特有的。DNA指紋的圖像在X光膠片中呈一系列條紋，很像商品上的條形碼。DNA指紋圖譜，開創了檢測DNA多態性（生物的不同個體或不同種群在DNA結構上存在著差異）的多種多樣的手段，如RFLP（限制性內切酶酶切片段長度多態性）分析、串聯重復序列分析、RAPD（隨機擴增多態性DNA）分析等等。各種分析方法均以DNA的多態性為基礎，產生具有高度個體特異性的DNA指紋圖譜，由于DNA指紋圖譜具有高度的變異性和穩定的遺傳性，且仍按簡單的孟德爾方式遺傳，成為目前最具吸引力的遺傳標記。
DNA指紋具有下述特點：1．高度的特異性：研究表明，兩個隨機個體具有相同DNA圖形的概率僅3×10－11；如果同時用兩種探針進行比較，兩個個體完全相同的概率小于5×10－19。全世界人口約50億，即5×109。因此，除非是同卵雙生子女，否則幾乎不可能有兩個人的DNA指紋的圖形完全相同。2．穩定的遺傳性：DNA是人的遺傳物質，其特征是由父母遺傳的。分析發現，DNA指紋圖譜中幾乎每一條帶紋都能在其雙親之一的圖譜中找到，這種帶紋符合經典的孟德爾遺傳規律，即雙方的特征平均傳遞50％給子代。3．體細胞穩定性：即同一個人的不同組織如血液、肌肉、毛發、精液等產生的DNA指紋圖形完全一致。
1985年Jefferys博士首先將DNA指紋技術應用于法醫鑒定。1989年該技術獲美國國會批準作為正式法庭物證手段。我國警方利用DNA指紋技術已偵破了數千例疑難案件。DNA指紋技術具有許多傳統法醫檢查方法不具備的優點，如它從四年前的精斑、血跡樣品中，仍能提取出DNA來作分析；如果用線粒體DNA檢查，時間還將延長。此外千年古尸的鑒定，在俄國革命時期被處決沙皇尼古拉的遺骸，以及最近在前南地區的一次意外事故中機毀人亡的已故美國商務部長布朗及其隨行人員的遺骸鑒定，都采用了DNA指紋技術。
此外，它在人類醫學中被用于個體鑒別、確定親緣關系、醫學診斷及尋找與疾病連鎖的遺傳標記；在動物進化學中可用于探明動物種群的起源及進化過程；在物種分類中，可用于區分不同物種，也有區分同一物種不同品系的潛力。在作物的基因定位及育種上也有非常廣泛的應用。
DNA指紋圖譜法的基本操作：從生物樣品中提取DNA（DNA一般都有部分的降解），可運用PCR技術擴增出高可變位點（如VNTR系統，串聯重復的小衛星DNA等）或者完整的基因組DNA，然后將擴增出的DNA酶切成DNA片斷，經瓊脂糖凝膠電泳，按分子量大小分離后，轉移至尼龍濾膜上，然后將已標記的小衛星DNA探針與膜上具有互補堿基序列的DNA片段雜交，用放射自顯影便可獲得DNA指紋圖譜。
瓊脂糖凝膠電泳是分離，鑒定和純化DNA片段的常規方法。利用低濃度的熒光嵌入染料-溴化乙錠進行染色，可確定DNA在凝膠中的位置。如有必要，還可以從凝膠中 回收DNA條帶，用于各種克隆操作。瓊脂糖凝膠的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝膠低，但其分離范圍較廣。用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為200bp至近50kbp的DNA。長度100kb或更大的DNA，可以通過電場方向呈周期性變化的脈沖電場凝膠電泳進行分離。
在基因工程的常規操作中，瓊脂糖凝膠電泳應用最為廣泛。它通常采用水平電泳裝置，在強度和方向恒定的電場下進行電泳。DNA分子在凝膠緩沖液（一般為堿性）中帶負電荷，在電場中由負極向正極遷移。DNA分子遷移的速率受分子大小，構象。電場強度和方向，堿基組成，溫度和嵌入染料等因素的影響。
三. 實驗材料和試劑
1. DNA樣品：犯罪現場DNA樣品（CS）、嫌疑犯1 DNA樣品（S1）、嫌疑犯2 DNA樣品（S2）、嫌疑犯3 DNA樣品（S3）、嫌疑犯4 DNA樣品（S4）、嫌疑犯5 DNA樣品（S5）
2.化學試劑和溶液
（1） DNA樣品反應緩沖液：100mM Tris, 200mM NaCl, 20mM MgCl2, 2mM DTT, pH 8.0。
（2）EcoRⅠ限制性內切酶
（3）PstⅠ限制性內切酶
（4）電泳緩沖液 （50×
（4）TAE
Tris 242g
冰醋酸 57.1ml
EDTA（0.5mol/L pH 8.0） 100ml
使用時用蒸餾水稀釋50倍。
（5）樣品緩沖液（DNA sample loading dye）
0.25%溴酚藍
0.25%二甲苯青
40%（W/V）蔗糖
（6）溴化乙錠（EB） 10mg/ml
（7）瓊脂糖agarose（電泳級）
（8）DNA分子量標記物：Lambda HindⅢ DNA markers
3. 儀器設備和消耗品
電泳儀、電泳槽、樣品梳、微波爐、水浴鍋、移液器（10μl，200μl，1000μl）、離心管、一次性槍頭（200μl，1000μl）。
四. 實驗步驟
1. DNA樣品的制備
采集生物檢測樣本，在弱堿和螯合劑存在條件下進行組織勻漿，溶解細胞或細胞核膜；利用陰離子去垢劑和蛋白酶，在37孵化數小時，消化蛋白質分離DNA；使用有機溶劑如苯酚、氯仿等除去殘余蛋白質，萃取DNA；用乙醇或某些鹽類從溶液中沉淀DNA。
由于一般采集的樣本中的DNA都有不同程度的降解，采用PCR技術擴增出完整的基因組DNA或者特定的高可變位點，以此制備出的DNA樣品備用。
2. DNA樣品的酶切反應
設置DNA樣品的雙酶切反應，按下列順序加樣（體積：μl）：
反應管 對照管
樣品DNA 10 10
反應緩沖液（10×） 2 2
雙蒸水 6 8
EcoRⅠ 1 0
PstⅠ 1 0
總體積 20 20
加完反應液，溫和混勻，置于37℃水浴中反應1小時，取出備用。
3. 酶切產物的瓊脂糖電泳
（1）在100ml電泳緩沖液（1TAE或0.5TBE）中加入1g瓊脂糖，加熱熔化，注意觀察，當心煮沸的液體，溢出！。當凝膠冷卻至60℃左右時加入5ul溴化乙錠溶液（終濃度為1ug/ml），充分混勻。
（2）先用透明膠帶封固膠托邊緣，放好梳子，然后再倒入凝膠（凝膠厚度在5mm左右）。
（3）在凝膠完全凝固后（室溫放置30-45分鐘），小心移去梳子和透明膠帶，將凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液（液面超過膠帶約2-3mm）。
（4）取已制備好的酶切DNA樣品，加入1/5樣品緩沖液，充分混勻。用移液器將樣品小心地加入點樣孔。在不同的點樣孔中，分別加入DNA分子量標記物，對照以及酶切DNA樣品各5-10ml。
（5）蓋上電泳槽，打開電源并調節電壓（通常用50-100伏），電泳40-60分鐘（注意：DNA樣品從負極向正極泳動）。
4. 結果觀察與分析
關閉電源，取出凝膠，在紫外燈下觀察DNA的遷移位置，并討論實驗結果。判斷CS與哪一個DNA樣品是同一個樣品，找出罪犯。
五. 注意事項
（1）酶切時，應盡量減少反應中的加水量以使反應體系減到最小。但要確保酶體積不超過反應總體積的十分之一，否則限制酶活性將受到甘油的抑制。
（2）進行酶切消化時，將除酶以外的所有反應成分加入后再從冰箱中取出酶，并應放置于冰上。每次取酶時都應換一個無菌吸頭 。操作要盡可能快，用完后立即將酶放回冰箱。
（3）溴化乙錠是一種強烈的致癌物質，使用時必須帶手套 。實驗結束后，含溴化乙錠的凝膠要進行凈化處理。
六. 思考題
對瓊脂糖凝膠的電泳結果進行簡單的描述，找出罪犯