DNA提取：為微生物研究掃清障礙

　　近年來，盡管測序技術在快速發展，但DNA提取方法卻鮮有改進。對于宏基因組研究，這是必需的一步。然而，許多微生物無法在實驗室中培養，這成為分析大量微生物樣品的一個主要瓶頸。參與美國NIH的人類微生物組計劃(Human Microbiome Project)以及地球微生物組計劃(Earth Microbiome Project)的科學家們也面臨這一問題。

　　參與這些計劃及其他計劃的微生物學家使用專門的試劑盒，他們利用機械和化學裂解以及DNA純化步驟，接著對16S rRNA基因進行PCR擴增，最后測序。但是他們發現，并非所有方法都是相似的，這不但影響結果的質量，還讓不同研究之間的結果難以比較。為了解決這些挑戰，多個研究小組都在優化DNA提取的效率，并研究不同步驟如何影響DNA的質量和產量。

　　例如，在上月發表在《PLoS ONE》的一項研究中，科羅拉多大學的微生物學家Gilberto Flores及其同事檢驗了一種由Sigma-Aldrich提供的直接PCR方法(Extract-N-Amp Plant PCR Kit)，開展人體各部位的細菌群落的16S rRNA基因分析。1 而傳統方法是先從樣品中提取和純化DNA，接著進行PCR擴增。研究人員將兩種方法進行了比較，發現結果相似，包括分類群豐富度、系統發育多樣性、單個分類群的相對豐度，以及各部位之間與個人之間在細菌群落組成上的差異。

　　此外，直接PCR方法比傳統方法至少快6-8倍，這讓它特別適合那些旨在經濟高效地分析人類微生物群落的結構和多樣性的高通量分析。目前，Flores正利用這種方法來研究不同身體部位的微生物群落如何隨時間而變化。不過，這種直接PCR方法可能不適合鳥槍法宏基因組分析，因為它通常需要更大量高度純化的DNA。

　　捕獲多樣性

　　除了改善DNA提取步驟的效率，另一個挑戰在于分離DNA，它們要能準確代表群落中微生物的多樣性。微生物對化學裂解步驟的敏感性不同。例如，革蘭氏陽性菌的細胞壁較厚，肽聚糖含量豐富。因此，DNA提取步驟可能在分離某些類型微生物的DNA時產生偏向。然而，研究人員事先并不知道群落中有哪些微生物，每種數量多少，因此無法判斷所使用的方法是否能準確代表樣品中的微生物多樣性。

　　過去，微生物學家選擇DNA提取方法似乎沒有明確的理由，而準確代表微生物多樣性這個標準也常常被忽視。根據《Science Translational Medicine》雜志的報道，愛達荷大學的微生物學家Larry Forney與合作者研究了陰道細菌群落組成的時間動態變化。2 他們采用特殊方法，以確保他們的分析可準確代表微生物樣品的多樣性。

　　Forney談道：“我們很久以前(17年前)就開始優化鑒定陰道微生物組的步驟，困擾我的是人們評估操作步驟有不同的標準，而你聽到的大部分是提高DNA的產量。人們基于各種原因選擇一種方法――供應商或他們閱讀的文獻，別人也用過，等等。而我認為更重要的標準是代表性。”

　　為了解決這一問題，Forney和他的團隊比較了六種常用的DNA提取步驟。他們使用mock群落，其中包含了數量相同的11種與人類關聯的細菌。根據今年3月發表在《PLoS ONE》雜志上的一篇文章，研究人員分析了mock群落中的16S rRNA基因序列，發現六種DNA提取方法在觀察到的物種豐度和預計的物種豐度之間都存在明顯差異。3 換句話說，沒有一種方法能準確代表mock群落的細菌多樣性。

　　然而，使用玻璃珠和溶菌酶(mutanolysin)的操作步驟可顯著改善細菌群落結構的代表性。總的來說，酶混合物可比單一酶更高效地裂解細胞。

　　研究人員還發現DNA產量與微生物多樣性之間沒有明顯關聯，也就是說，那些DNA產量高的試劑盒并不一定能準確反映群落中各種細菌的相對豐度。

　　Forney認為：“如果你有兩種細菌的混合物，一種100%裂解，而另一種0%裂解，那么你可能會得到相當多的DNA，但它不能代表樣品中的東西。我想做的一件事情是提高對不同方法之間差異的認識，這樣人們會考慮他所用的方法，而不是簡單地使用現成產品，或價格最低的產品。”

　　黑匣子

　　考慮到不同方法之間DNA產量和代表性的差異，Forney的研究強調了鑒定方法和策略的重要性，以便于樣品之間的比較。基于這一理由，地球微生物組計劃選擇了標準化的DNA提取步驟。項目成員Janet Jansson認為：“為了研究之間的比較，盡可能依靠標準化方法很重要，當然，困難樣品除外。”

　　作為一名博士研究生，Jansson開發出從土壤中提取DNA的步驟，與市售試劑盒的產量相似。因此，她也將這一步驟用于人類糞便和生物活檢樣品。“土壤是最困難的樣品類型。如果你能從土壤中獲得DNA，那么你幾乎能從任何東西中獲得DNA。”

　　Jansson認為玻璃珠裂解是最好的機械破碎法，可提高DNA產量以及細菌群落的代表性。不過，它也會將基因組DNA打成小片段，在后續PCR反應中引入偏向。此外，近期一項發表在《Journal of Microbiological Methods》的研究發現，這種機械破碎方法會降低從腸道組織中提取的DNA的質量。4

　　在這項研究中，玻璃珠增加了微生物DNA的量，但似乎也增加了宿主DNA的量。讓人奇怪的是，玻璃珠裂解降低了從革蘭氏陽性菌中提取的DNA量。這表明，相對輕柔的機械破碎法(如渦旋)，再加上化學處理，才能裂解腸道組織的微生物細胞。文章的通訊作者，伊利諾伊大學宿主-腸道微生物相互作用的專家 H. Rex Gaskins認為：“玻璃珠可能對這些樣品太過劇烈。”

　　盡管這些工作比較了不同DNA提取技術的效果，但微生物學家仍然面對巨大的未知數。Jansson將樣品比喻成“黑匣子”。他談道：“當你有一個未知樣品時，你知道肯定有偏向，但除非你對樣品中的每種生物測序，否則你永遠不知道偏向是什么。因此，你無法知道是否從每個細胞中提取出DNA。這仍是一個主要的障礙，我真的不知道如何去解決。”