斑點和狹線印跡實驗,可用于檢測被印跡的1DNA制品中靶序列的相對豐度。主要應用(1)遺傳病診斷;(2)DNA圖譜分析;(3)檢測樣品中的DNA及其含量;(4)PCR產物分析。
| 實驗方法原理 | 斑點和狹線印跡是一種將混合的未經分離的面定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上進行雜交分析的技術。 |
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| 實驗材料 | DNA |
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| 試劑、試劑盒 | SSCNaClNaOHTris·Cl |
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| 儀器、耗材 | 紫外透射儀電泳儀多樣抽濾加樣器 |
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| 實驗步驟 | 1. 裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的尼龍膜,將膜置于6xSSC的表面讓其自然浸沒。放置10 min。 2. 裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的Whatman 3 MM 濾紙,用6xSSC浸濕。 3. 將Whatman 3 MM 濾紙置于多樣抽濾加樣器上,將膜放置于其上。將多樣抽濾加樣器按廠商說明書安裝好,確保裝置中不漏氣。
4. 在DNA中加入20xSSC使其終濃度為6×SSC,體積為200~400 ul,在100℃變性10 min,然后置于冰中。 5. 連接吸液裝置與多樣抽濾加樣器,每孔中加入500 ul 6xSSC。 6. 將DNA樣品離心5 s,將樣品加于各孔中,小心勿讓吸頭觸及膜,讓樣品濾過。
7. 拆開多樣過濾加樣器裝置,將膜置于一張浸過變性液的Whatman 3 MM 濾紙上,放置10 min。 8. 將膜轉至一張浸過中和液的的Whatman 3 MM 濾紙上。放置5 min。
9. 將膜置于一張Whatman 3 MM 濾紙上,晾干。 10. 將尼龍膜置于可透過紫外線的塑料夾層中,將有DNA的一面朝下置于紫外透射儀上照射適當的時間以固定DNA。 11. 將晾干的膜夾于Whatman 3 MM 濾紙之間,室溫下可保存數月。 收起 |
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| 注意事項 | 在膜上陽性反應呈帶狀。實驗中應注意以下問題:轉膜必需充分,要保證DNA已轉到膜上。雜交條件及漂洗是保證陽性結果和背景反差對比好的關鍵。洗膜不充分會導致背景太深,洗膜過度又可能導致假陰性。若用到有毒物質,必需注意環保及安全。 |
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| 其他 | 主要應用
1.遺傳病診斷
2.DNA圖譜分析
3.檢測樣品中的DNA及其含量
4.PCR產物分析 |
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