DNA結合蛋白測定實驗

質粒DNA

dNTPDNA聚合酶Klenow酶TETAE溴化乙錠TEMED過硫酸銨BSA

培養箱離心管

1.  用一種或多種限制性內切酶在100 μl 體積中消化10 μg 質粒人，產生25~100 bp  的含有結合位點的DNA片段，并至少有一端是5’突出的。

2.  加100 μCi［α-³²P］dNTP，4μl 5 mmol/l 3種NTP的混合液，2.5U Klenow酶。室溫溫育20 min。
 

3.  加4 μl 含有5 mmol/l 與被標記的相同的dNTP溶液，室溫溫育5 min。

4.  沉淀DNA，溶解于TE中。

5.  加10×加樣緩沖液，用2%小型瓊脂凝膠（含溴化乙錠5 μg/ml）在TAE或TBE緩沖液中進行電泳。

6.  在長波透射紫外燈下觀察電泳帶。在帶的下游切一平行縫隙，插入一片DEAE膜（先在凝膠緩沖液中浸濕）。將膜緊擠于膠中，繼續電泳直到泳動至膜上。

7.  將膜在電泳緩沖液中洗一下，在濾紙上吸干。將膜放入1.5 ml 螺口蓋的圓底管底部，其中裝有400 μl DEAE洗脫液，68℃水浴30 min。

8.  將洗脫液移入1.5 ml 的離心管中，4℃微量離心15 min。將上清轉入干凈管中，留10 μl 于原管管底。

9.  在上清中加入4 μl 1 mol/l MgCl₂。用1 ml 100%乙醇沉淀DNA，重懸于100 μl TE緩沖液中。

10.  取1 μl 測定cpm/μl min，用溴化乙錠打點法定量估計DNA濃度。

11.  安裝16 cm 長的電泳玻璃板和1. 5 mm 厚的墊片。在40 ml 低離子強度凝膠混合液中加100 μl 30%的過硫酸銨及34 μl TDMED，灌入玻璃板之間，插入齒寬≥7 mm 的梳子。讓膠聚合20 min。

12.  將梳子和底邊的墊片取出。將膠放入盛有低離子強度電泳緩沖液的電泳漕中，用雙頭泵以5~30 ml/min 循環電泳緩沖液。100 V（約22mA）預電泳90 min以上， 

13.  在微量離心管中，加終體積15 μl 的下列成分：10 000 c/min 的DNA探針，終濃度300 μg/ml BSA，及取自緩沖液中的粗制蛋白提取物中的大約15 μg 蛋白質。混勻，置30℃水浴15 min。

14.  在1個加樣孔加入少量10×加樣緩沖液并讓染料跑進膠。在其他孔中加各結合反應液，在約30~35mA下電泳，直至溴酚藍（相當于約70 bp 的條帶）達到膠底。

15.  卸下凝膠電泳裝置，撬開電泳玻璃板，將粘附了凝膠的玻璃板平放在實驗臺上，在膠上放置3張Whatman 3MM濾紙。將濾紙連同凝膠一起揭下。

16.  用塑料薄膜包裹凝膠進行真空干燥。在不使用增感屏的條件下，凝膠膜放射自顯影過夜，或用增慼屏放射自顯影2~3 h。

1. 目的DNA的長度應小于300bp，以有利于非結合探針和蛋白DNA復合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實驗中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應用短的寡核苷酸片段（約為25bp）,這樣結合位點可和其他因子的結合位點區別開。長的限制性酶切片段可用于對推定的啟動子/增強子區域內的蛋白結合位點定位。隨后可用DNaseI 印跡對蛋白結合的特異區域在DNA序列水平上作出分析。

2. 凝膠遷移實驗需要的結合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質抽提液。還必須制備同位素標記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用g-32P和T4多核苷酸激酶來作末端標記，同位素標記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標記的核苷酸在體外合成。結合反應所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（Tris-HCl或HEPES）、還原劑（DTT）、甘油、非特異的競爭DNA（poly(dI:dC)(dI:dC)），也可能含非離子去污劑。在結合蛋白和同位素標記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影， 或用PhosphorImage分析。

3. 凝膠遷移實驗在理論上很簡單也很快速，但要成功地進行凝膠遷移實驗，需要優化一些參數，這主要受結合蛋白的來源和探針結合位點特點的影響。以下是需要優化的因素：抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解），結合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH, 聚丙烯凝膠電泳的特點和電泳條件，保溫時間和溫度，載體蛋白， 是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素）。總之，反應總體積應最小（20uL）。