磷酸化化學計量的確定及磷蛋白形成動力學的測定
l 磷酸化作用化學計量的確定
1．在冰上建立下列反應混合液：
Tris-HCl（50mmol/L；pH8.0）/MgCl2（10mmol/L） 250μl
ATP（10mmol/L） 1μl
純化的DNA結合蛋白（1mg/ml） 4μl
[γ-32P]ATP（13μCi） 1.3μl
2．將反應液混合物分成125μl的兩個部分，記為A部分和B部分。B部分將被用于動力學實驗。
3．在6個干凈管中各加入20μl A部分溶液，然后各管中依次加入0，0.5，1，2，3和4微單位的蛋白激酶以開始磷酸化測試。室溫下反應30分鐘。
4．將10μl每一磷酸化測試混合液點在一張50px×50px的Whatman 3MM濾紙上，將該濾紙在10％TCA/1%焦磷酸鈉溶液中洗10分鐘（每張濾紙用5ml溶液）。更換溶液重復洗兩次。用100％乙醇洗濾紙。通過對每張濾紙所發出放射性的計數來確定每個樣品中磷蛋白的摻入量。
5．在每個管中加入1.1μl 100％TCA以沉淀管中剩余的10μl磷酸化測試混合液。在冰上放置20分鐘，室溫下用微型離心機在10 000r/min離心10分鐘以收集蛋白質沉淀。先用90％后用100％丙酮洗沉淀。在空氣中干燥沉淀5分鐘。
6．將樣品加到SDS－聚丙烯酰胺凝膠的加樣孔中，在160V下1×電泳緩沖液（10×貯液配制）中電泳40分鐘。用Saran?膜包裹濕膠，對X光片曝光3小時左右。
7．以放射自顯影膠片為模板，切下與DNA結合蛋白相對應的被標記的條帶。用5倍體積30％過氧化氫在37℃處理凝膠條帶6～12小時以溶解DNA結合蛋白。通過對每個樣品的契侖科夫放射的計數來確定磷蛋白的摻入量。
8．用以下兩種方法測定待測液中的總摻入量：
a． 將9μl分析緩沖液（50mmol/L Tris-HCl pH8.0/10mmol/L MgCl2）加到1μl A部分溶液中，將混合液點在一張50px×50px的Whatman 3MM濾紙上。不要用TCA處理濾紙。對濾紙所發出的放射性進行計數。
b．將1μl A部分溶液加到適當體積的30％過氧化氫溶液中，并對契侖科夫放射性進行計數。
9．計算摻入到蛋白質中的磷酸的莫爾數。在本實驗中，每個分析包含800 pmol ATP和8 pmol（0.3μg）蛋白（如果待測DNA結合蛋白是GBF1的話，其分子量為37 000）。1％摻入蛋白中的放射性相當于每莫爾蛋白含有1摩爾磷酸。
[NextPage]
l 磷蛋白形成動力學的測定
1．向B部分中加入18微單位蛋白激酶并在室溫下放置。在第0，5，10，20，25和30分鐘時各取20μl試樣。取出后立即終止磷酸化反應，取其中10μl點在一張50px×50px的Whatman 3MM濾紙上，并用TCA處理，剩余10μl用1.1μl 100％TCA沉淀。
2．來自B部分樣品的處理方法與A部分相同。
3．確定磷蛋白形成的速率。
[NextPage]
l 變性SDS－聚丙烯酰胺凝膠的制備
磷酸化反應洗濾紙時是制膠的良機。
1．依次混合下列組分以配制10％丙稀酰胺分離膠溶液：
丙稀酰胺/雙丙稀酰胺（30％） 3.38ml
Tris-HCl（1mol/L; pH8.8） 3.80ml
SDS（10％） 0.10ml
加水至10ml。加入50％APS 12μl和TEMED 10μl，重復混勻（這些足以灌制兩塊207.50000000000003px×185px×1.875px的微型凝膠）。將溶液注入灌膠的平板夾層中使其充滿兩塊平板間空隙的80％，用水覆蓋凝膠，靜置10分鐘使凝膠聚合。吸去水層。
2．依次混合下列組分以配制4％丙稀酰胺濃縮膠溶液：
丙稀酰胺/雙丙稀酰胺（30％） 0.27ml
Tris-HCl(1mol/L; pH6.8) 0.25ml
甘油 0.20ml
SDS（10％） 20μl
加水至2ml，再加入50％ APS 2.4μl和TEMED 2μl，并將溶液加到分離膠上至低于矮平板上沿5mm處，插上梳子。該膠可在室溫下存放數小時或裝在密封的塑料袋中于4℃放置數天備用。
[NextPage]
用放射性標記的磷蛋白和非標記的DNA探針進行遷移率變動分析：磷酸化蛋白與DNA的結合
l 遷移率變動測定
1．將2μl近似飽和磷酸化的DNA結合蛋白加入到110μl未用poly(dI-dC)配制的遷移率變動緩沖液中。
2．取20μl到一個干凈管中作為對照（樣品1），在剩余92μl中加入poly(dI-dC)至終濃度為0.07μg/μl，并取出4份各20μl的等分試樣（樣品2～5）。
3．分別在樣品2，3和4中加入0，2和10ng非標記的DNA探針，在樣品5中加入0.1μg超聲處理的鮭精DNA，并將樣品1～5于室溫放置30分鐘。
4．在每個樣品中加入5μl非變性上樣緩沖液，并將樣品加到非變性聚丙烯酰胺凝膠的加樣孔中，以低于100V的電壓在1×電泳緩沖液中電泳3小時。用Saran?膜包裹濕膠，對X光片過夜曝光。更好的方法是在Whatman 3MM濾紙上干燥凝膠，加Kodak增感屏對X光片曝光。
l 非變性聚丙烯凝膠的制備
在結合分析反應時倒膠比較合適。
1．依次混合下列組分以配制4％非變性丙稀酰胺凝膠溶液：
丙稀酰胺/雙丙稀酰胺（30％） 6.6ml
電泳緩沖液（10×） 5ml
加水至50ml，并加入50％ APS 60μl和TEMED 50μl。
2．充分混勻，將溶液倒入垂直凝膠電泳裝置的平板夾層中（362.5px×425px×5px）。本方法不需濃縮膠，因為分離膠具有自濃縮作用。聚合約需10分鐘。該膠可浸泡在1×電泳緩沖液中于4℃保存數周備用。
[NextPage] 用非標記的磷酸蛋白和放射性標記的DNA探針進行遷移率變動分析：磷酸化的蛋白與DNA的結合 l DNA結合蛋白的磷酸化作用 1．向100μl磷酸化緩沖液中加入800ng DNA結合蛋白，并將其中10μl轉至一個裝有1μl 4mmol/L ATP的管中—作為無激酶的對照樣品（樣品1）；在剩余90μl中加入9微單位蛋白激酶，然后取10μl到一個干凈管中—作為無ATP的對照樣品（樣品2）。 2．將剩余80μl分為4份，每份20μl（樣品3～6），并依次向樣品3，4，5和6中加入4mmol/L ATP 2μl，4mmol/L GTP 2μl，4mmol/L GTP 2μl和4mmol/L UTP 2μl。 3．在室溫下讓樣品1～6反應20分鐘。 4．向樣品1和2中加入100mmol/L EDTA 1.5μl，樣品3～6中加入100mmol/L EDTA 3μl以終止反應。每個管中EDTA的終濃度約15mmol/L，置樣品于冰上。 l 磷酸化對結合動力學的影響 1．將2μl樣品3和5（即分別在ATP和CTP存在下DNA結合蛋白被磷酸化）分別加到20μl含有放射性標記的DNA探針的遷移率變動緩沖液中，通過在室溫下反應不同的時間來建立一個“交叉開始”時程，反應時間按從向遷移率變動緩沖液中加磷蛋白起到電泳開始時止計算。由于所有樣品要在一塊膠上平行地進行分析，而本實驗不可能讓所有反應同時開始然后在合適的時間點處取樣――如果不破壞結合復合物結合反應就不能被輕易中止。因此必須在走膠開始前80分鐘開始第一對反應，前40分鐘開始第2對，前20分鐘開始第3對，前10分鐘開始第4對，這樣就可以獲得80，40，20和10分鐘時間點的樣品。 2．向每個樣品中加入5μl非變性加樣緩沖液。首先上反應時間最長的樣品到凝膠上，這樣反應10分鐘的樣品的反應時間不至延長太多。為了得到0時刻的樣品，在冰上向遷移率變動緩沖液中加入磷蛋白樣品，混勻，加到凝膠中，立即開始電泳。在1×電極緩沖液中加入磷蛋白樣品，混勻，加到凝膠中，立即開始電泳。在1×電極緩沖液中以低于100V的電壓電泳3小時。 3．吸干凝膠，對X光片曝光過夜。 l 不同磷酸供體的影響 1．分別將2μl樣品1～6（見上文）加入到20μl含有放射性標記的DNA探針的遷移率變動緩沖液中，室溫下反應30分鐘。 2．向每個樣品中加入5μl非變性加樣緩沖液，并將樣品加到非變性聚丙烯酰胺凝膠上，在1×電極緩沖液以低于100V的電壓電泳3小時。 3．吸干凝膠，對X光片曝光過夜。