DNA聚合酶I的二級結構以螺旋為主，可劃分為A至R共18個螺旋肽段。螺旋肽段之間由非螺旋結構連接。其中H區與I區之間的無規則結構較長，有50個氨基酸殘基，I螺旋與O螺旋之間由較大的空隙，可以容納DNA鏈，而50個氨基酸的無規結構，就像一個蓋子那樣與I、O螺旋區共同把DNA鏈包圍起來，使其向一個方向滑動。DNA聚合酶I只能催化延長約20個核苷酸左右，說明它不是復制延長過程中起作用的酶。DNA聚合酶I在活細胞內的功能，主要是對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現的空隙進行填補。[1]
