DNA的酶切與連接

實驗方法原理 限制性內切酶能夠特異性地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異性位點上，并切割雙鏈DNA。

實驗材料 標準pUC19（2686bp）

試劑、試劑盒 EcoRI及其配套的酶切緩沖液 0.5×TBE電泳緩沖液 6×Loading Buffer Goldview 瓊脂糖

儀器、耗材 水平電泳儀 水浴鍋 移液器 微波爐 成像設備

實驗步驟

1.在200ul的離心管中，按照下表加入試劑（單位：ul），混勻；點動離心將反應液甩至管底。37℃保溫2h進行酶切反應。

2.反應結束后，加入2ul  10×Loading Buffer鈍化酶活性；（或：65℃，保溫20min使酶失活）。

3.電泳檢測。

酶切陰性對照：pUC19標樣+10×Loading Buffer 2ul

酶切樣品：標準pUC19酶切樣品10ul + 10×Loading Buffer 2ul

4.質粒及酶切樣品電泳預期結果。

注意事項

影響酶切的因素：在酶切反應中，DNA的純度、緩沖液中的離子強度、Mg2+等因素均可影響反應，一般可通過增加酶的用量，延長反應時間等措施以達到完全酶切。但應注意的是，過多的酶量和過長的反應時間會造成非特異性的酶切（星號活性）。