DNA酶解及DNA片段瓊脂糖凝膠電泳

【目的要求】
1.掌握限制性核酸內切酶概念、特點及作用原理，DNA酶解技術的應用
2.掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段原理及其操作
3.熟悉電泳基本原理及其影響因素
【教學內容】
1．限制性核酸內切酶概念、特點及作用原理，DNA酶解技術的應用
2．DNA片段瓊脂糖凝膠電泳
3．電泳概念、分類、應用、基本原理及其影響因素，瓊脂糖凝膠制備、加樣、電泳及結果分析
【實驗】
一．DNA酶解
原理：
1.限制性核酸內切酶：是一類能識別并水解雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶。一般能識別4-6個堿基對，并在特定位點切割。如：HindⅢ A↓A G C T T
EcoRⅠ G↓A A T T C
HpuⅡ C↓C G G
2.酶單位數：在最適溫度、PH條件下，1小時完全水解1μgλDNA所需的酶量為1個單位。
試劑：
(1)λDNA（0.38μg/μl）
(2)HindⅢ (16u/μl)
(3)酶解Buffer(Tris-HCl,NaCl,MgCl2,DTT )
(4)反應終止液（溴酚藍1%，SDS 1%，EDTA 2%，甘油50%）
方法：1.取兩只EP管充分混勻
（1）λDNA 10μl，雙蒸水 10μl
（2）λDNA 10μl，HindⅢ 10μl
2.37℃水浴2小時。
3.保溫結束后加入終止液5μl。
二.瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段（水平潛水式）
原理：
1． DNA含有PO43-基團，在pH7.5 Buffer中帶負電,在電場中向正極移動。由于不同大小的DNA片段的電荷密度大致相同，自由電泳時，各核酸分子的遷移率區別很小，難以分開
2． 選用適當濃度的凝膠作為支持物，使之具備一定的孔徑，即可發揮分子篩效應（凝膠孔徑對大小不同的分子有不同的阻力），使大小不同的核酸片段遷移率出現較大差異，達到分離的目的，同樣條件對Maker電泳，對比觀察DNA酶解效果

3． DNA經溴乙錠（EB）染色，溴乙錠可以插入DNA雙螺旋結構兩個堿基之間，與核酸形成絡合物，在紫外（300nm,360nm）激發下，產生桔黃色熒光（590 nm可見光）。標準Maker經溴乙錠（EB）染色可以觀察到6條帶，分別為: 23Kb,9.9Kb,4.4Kb,4.3Kb,2.2Kb,2.0Kb
試劑：（1）1%瓊脂糖（2）TAE液（3）Marker（4）EB
方法：
1.電泳儀接線：黑（負）—黑，紅（正）—紅
2．凝膠槽準備：用膠布固定膠槽兩側，調整梳子高度距離槽底2-3毫米，調好水平。
3．灌膠：
(1)稱取0.8克瓊脂糖,加入80毫升TAE中,熱浴溶解至透明
(2)60℃左右加入EB100μl(終濃度0.5μg/ml),倒入備好的凝膠槽中。應注意膠面平整,無氣泡
(3)冷卻后,拔去梳子
4．加樣:
(1)去掉膠布，將灌好的膠板平放在電泳槽中
(2)加入電極Buffer使之高出膠面(1-3毫米)
(3)用進樣器吸樣品20μl加入樣品槽中
5．電泳: v = 100V,1-1.5小時,至溴酚藍移出2/3
6．觀察: (戴手套)紫外燈下（254-365nm）,暗處觀察,記錄。可見DNA橙紅色區帶
【注意事項】
1．在EP管加入試劑時要用漩渦混合器混合后離心。
2．瓊脂糖凝膠電泳時加樣側應位于負極端。
3．溴乙錠可引起基因突變，操作時要注意個人防護。
4．紫外光對人眼有害，觀察時加蓋玻璃罩，觀察時間不宜太長。