【原理】
限制性內切酶(restrictionendonuclease，RE)是由細菌自己產生的能識別雙鏈DNA分子中的特定堿基順序，并以內切方式水解核酸中的磷酸二酯鍵的核酸水解酶。它可分為三種類型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的RE，能識別雙鏈DNA的特異順序，并在這個順序內進行切割。它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被譽為分子生物學家的手術刀。臨床上某些遺傳病是由于基因的缺失或插入或突變所致，可造成RE酶切位點的改變，故當用一定的RE切割時，其切開的片段(分子量)大小與正常人發生差異，即DNA限制性圖譜發生改變，據此可達到基因診斷的目的。
實驗可選用價格低廉、酶切效果好的EcoRⅠ(識別位點G↓AATTC)對λDNA進行酶切，觀察RE的特定切割作用及其限制性圖譜，理論上可產生分子量分別為21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp和3530bp片段。
本實驗是將實驗十制備的人Bcl-2重組質粒DNA作為EcoRⅠ酶切底物。人Bcl-2重組質粒是EcoRⅠ單酶切的pBluescriptⅡKS(-)載體與EcoRⅠ單酶切的人Bcl-2cDNA重組而成的，大小為4861bp，前者是一種由pUC19質粒衍生而來的具有2961bp的質粒載體。因此用EcoRⅠ酶切則應得到空載pBluescriptⅡKS(-)載體(2.96kb)和人Bcl-2cDNA(1.9kb)兩個片段。經瓊脂糖凝膠電泳后可較容易鑒定鑒定該質粒中的插入片段。
【試劑】
1．DNA底物λDNA或制備的肝組織DNA或實驗十制備的EcoRⅠ非定向克隆構建的人Bcl-2重組質粒DNA。
2．限制性內切酶EcoRⅠ及其緩沖液只需購買國內試劑公司的產品即可，每種RE均配有2種緩沖液，在配套的緩沖液中該RE均可獲得100%酶切活性。
3．50×TAE電泳緩沖液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸餾水至100ml。1×TAE為配制瓊脂糖凝膠及其電泳的應用緩沖液。
4．溴酚藍指示劑溶液(6×上樣緩沖液)稱取溴酚藍100mg，加雙蒸水5ml，在室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍溶液中，搖勻后定容至50ml，加入NaOH1滴，調至藍色。
5．溴化乙錠(EB，1mg/ml)戴手套謹慎稱取EB20mg于棕色試劑瓶中，加20ml雙蒸水，溶解后貯于4℃備用，配制瓊脂糖凝膠時每100ml凝膠加50μlEB。
6．DNA分子量標準根據需要購買，一般濃度為0.5μg/μl。
【操作步驟】
1．將下列試劑緩沖液2μl，λDNA(5μg)或基因組DNA(5μg)或質粒DNA樣品(1μg)，EcoRⅠ5～10U加至0.5mlEP管中，加雙蒸水至20μl，加蓋，混勻后稍離心，37℃水浴反應1h。
2．制備瓊脂糖凝膠按照被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量，見表。
表瓊脂糖凝膠濃度與分辨DNA大小范圍的關系
凝膠中的瓊脂糖含量[%(w/v)]線性DNA分子的有效分離范圍(kb)
0.35～60
0.61～20
0.70.8～10
0.90.5～7
1.20.4～6
1.50.2～3
2.00.1～2
稱取0.8g瓊脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE緩沖液100ml，置微波爐或水浴加熱至完全熔化，取出搖勻，稍冷卻后加50μlEB染色液，搖勻。
3．灌膠
(1)取潔凈的電泳內槽(又稱托盤)，用橡皮膏或透明膠帶將內槽的兩端邊緣封好(一定要封嚴，不能留縫隙)。
(2)將內槽放置于一水平臺面，并插好所需齒數和厚度的樣品梳子。
(3)將冷卻至60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩慢倒入內槽，直至所需厚度，注意不要形成氣泡，特別是梳子下，如有氣泡可用牙簽挑破。
(4)待膠凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明膠帶，將帶凝膠的內槽放入電泳槽中，注意凝膠點樣端要靠近負極。
(5)加入1×TAE緩沖液至電泳槽，緩沖液剛沒過凝膠表面即可。
4．加樣剪取適當大小的蠟膜(Parafilm膜)，取6×上樣緩沖液1μl點于膜上數點。取5μl酶切后的樣品，0.5～1μg未酶切質粒DNA，DNA分子量標準分別與上樣緩沖液混勻。將其分別加入凝膠的點樣孔(記錄點樣順序及點樣量)。
5．電泳接通電源槽與電泳儀的電源(檢查正負極，DNA片段是從負極向正極移動)。DNA的遷移率與電壓成正比，電壓不超過5V/cm凝膠長度。當溴酚藍染料移動至凝膠前沿1～2cm處，切斷電源，停止電泳。
6．觀察結果取出內槽，在紫外分析儀的玻璃平板上小心推出凝膠，通過防護屏或戴防護眼鏡觀察紫外燈透射的結果，DNA存在處應顯出桔紅色熒光條帶，可觀察到酶切與未酶切后的DNA帶的泳動位置。
7．攝影在鏡頭前加一塊紅色濾光片，使用100o黑白膠卷，利用透射紫外光作光源，光圈2.8，曝光0.5～2s，調準焦距，可拍攝質量較好的凝膠照片。有條件則使用DNA一次成像儀。
【注意事項】
1．本實驗可先進行酶切反應，酶切過程等時間的間隙灌好瓊脂糖凝膠。
2．進行DNA酶切時，要在其最適溫度下(大多數為37℃)進行。最好是用每一種酶的專用緩沖液，以達到最佳酶切效率。如遇2種酶酶切應先用低鹽緩沖液后用高鹽緩沖液，或一種酶切結束后加TE至400μl，再進行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，重新建立第二個酶切反應體系。
3．RE一定要在低溫(－20℃)下貯存，因含50%甘油，在此溫度下一般不會結冰，如結冰則表明冰箱溫度低于－20℃，應避免結冰。新購的大包裝酶，應先分裝。每次吸取后均應將RE管放在冰盒內，用完后立即放在－20℃，每次取酶盡可能使用新的滅菌tip，避免污染。
4．進行大量酶切時，先要確定RE的濃度。一般1URE于37℃條件下作用底物DNA1h以上可切割1μgDNA。一般來說，要用2～3倍才能保證完全消化，對基因組DNA尤其如此。
5．酶切基因組DNA是否完全可通過紫外觀察結果來判斷，如看到DNA片段呈均一遞減的一條區帶，則表示酶切完全。
6．對多個樣品基因組DNA分別酶切電泳攝影，繪制出多個樣品的DNA限制性內切酶圖譜，即可分析作出基因診斷。
7．為便于電泳后直接可觀察結果，EB可在瓊脂糖加熱熔化至灌膠前加入。EB是DNA的誘變劑，亦是極強的致癌物，配制和使用過程中要小心，操作時一定要戴手套，用過的手套要及時把手套順手翻過來，讓污染有EB的面朝里，有EB的廢液和器皿要分別處理好。