1.目的與原理
實驗目的:
學習DNA的Feulgen染色方法,觀察染色結果,了解反應原理。
實驗原理:
DNA經弱酸(1mol/L HCl)水解,其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打開,使脫氧核糖的一端形成游離的醛基,這些醛基在原位與Schiff試劑(無色品紅亞硫酸溶液)反應,形成紫紅色的化合物,使細胞內含有DNA的部位呈紫紅色陽性反應。紫紅色的產生,是由于反應產物的分子內含有醌基,醌基是一個發色團,所以具有顏色。對照組預先用熱三氯醋酸或DNA酶處理,抽提去細胞中的DNA而得到陰性反應,從而證明了Feulgen反應的專一性。
2.實驗用品
材料:
(1).Carnoy液固定的鼠肝石蠟切片
(2).Carnoy液固定的洋蔥根尖或蠶豆根尖切片。
試劑:
(1).Carnoy固定液:3份95%酒精加入1份冰醋酸。
(2).1 mol/L HCl:取比重1.18的濃HCl 82.5ml,加水至100ml。
(3).Schiff試劑
先將200ml蒸餾水煮沸,由火上取下,加入堿性品紅1g,充分攪拌,有助于溶解。待先將200ml蒸餾水煮沸,由火上取下,加入堿性品紅1g,充分攪拌,有助于溶解。待亞硫酸鉀或偏亞硫酸鈉充分振蕩后蓋緊瓶塞,放于暗處過夜。次日取出,呈淡黃色或近于無色,加中性活性炭一匙,約0.5g,劇烈振蕩1min,過濾后即得無色品紅。無色品紅配成后須塞緊瓶塞。外包黑布或黑紙,貯存在冰箱或黑暗低溫處。
(4).亞硫酸水溶液(漂白液)
10%偏重亞硫酸鈉水溶液5ml,蒸餾水100ml,1 mol/L HCl 5ml,搖勻,塞緊瓶塞。此溶液在使用前配制,否則會因二氧化硫的逸出而失效。
(5).5%三氯醋酸
(6).0.5%固綠酒精溶液(95%酒精溶解)
石蠟切片→溶臘二甲苯Ⅰ(3~5min)→溶臘二甲苯Ⅱ(3~5min)→1/2純酒精+1/2二甲苯(3~5min)→純酒精Ⅰ(2~3min)→純酒精Ⅱ(2~3min)→95%酒精 (2~3min)→83%酒精(2~ 3min)→70%酒精(2~3min)→蒸餾水→5%三氯醋酸,90℃,15min→70%酒精(2~3min)→蒸餾水(過一下)→1mol/L HCl 60℃,8~15min(水浴或溫箱中)→Schiff試劑(60~90min)→亞硫酸水(Ⅰ Ⅱ Ⅲ)(各5min)→流水沖洗(5~15min)→蒸餾水→0.5%固綠水溶液(復染)(1min)(此步要快,以免過染)→蒸餾水→70%酒精→83%酒精→95%酒精→純酒精Ⅰ→純酒精Ⅱ→透明二甲苯Ⅰ→透明二甲苯Ⅱ→封片(貼上標簽,注明材料,反應名稱,作者姓名及日期)
顯微鏡下檢查:
實驗組:細胞核呈紫紅色,核仁及細胞質呈綠色
對照組:由于DNA被提取破壞,所以細胞核無紫紅色。