ELISA三種常見測定方法及原理分析

酶聯免疫吸附測定法（ELISA）是一種使用酶標儀進行測定的免疫測定法，用于檢測和定量生物分子，例如抗體、蛋白質、激素或肽，以及表征蛋白質-蛋白質和蛋白質-核酸相互作用。在ELISA中，將用于實驗的靶標（通常是抗原）固定在固體表面上，然后用辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的酶綴合抗體進行檢測。通過與被酶催化的底物孵育來實現定量，從而產生可測量的副產物。

酶聯免疫吸附測定（ELISA）概述

ELISA測定法通常在96孔板中進行。這些板被設計成通常通過直接吸附到微量滴定板的表面上或間接地通過預先包被的抗體間接地結合和固定抗原。固定后，將一抗引入樣品中，與抗原形成免疫復合物。一抗可以共價標記到酶（例如HRP）上，或者如果一抗被生物素標記，則一抗本身可以使用酶標記的二級抗體或鏈霉親和素偶聯物間接檢測。通過與合適的底物孵育來評估共軛酶的活性，從而實現檢測，該底物會產生可測量的副產物。試劑盒在靈敏度和成像設備的兼容性方面各不相同。

直接與間接檢測

在ELISA中檢測一級抗體-抗原復合物的方法可以是直接的或間接的（圖1）。在直接檢測方法中，與報告酶（例如HRP或AP）綴合的單一一抗可以直接檢測靶抗原。通過間接檢測，可以依次使用雙抗體系統檢測目標靶標。首先，將樣品與針對目標抗原的未標記一抗孵育。然后，使用一抗特異的酶標二抗檢測其存在，從而檢測靶抗原。如果使用生物素化的一抗檢測抗原，則使用酶標記的抗生蛋白鏈菌素偶聯物作為您的第二檢測試劑。

使用哪種檢測方法取決于靶抗原的表達水平。為了檢測高度表達的抗原，直接檢測是合適的方法。當靈敏度至關重要時，例如檢測低豐度靶標或表達不良的抗原，請使用間接檢測方法來增強信號。

圖1.使用靶標特異性抗體進行直接和間接抗原檢測的圖示。

ELISA的三種檢測方法

1.直接法

在直接ELISA中，抗原通過被動吸附直接固定在板的表面，并使用HRP標記的一抗進行檢測。將無色底物引入樣品，該底物與酶結合物反應，并產生可測量的副產物。根據底物的選擇，該副產物可以是比色的，化學發光的或熒光的。信號產生的大小與樣品中抗原的數量成正比。在所有ELISA法中，直接ELISA分析最簡單，執行最快，但靈敏度最低。

2.間接法

間接ELISA本質上是直接ELISA的修改版本。在間接ELISA中，用于檢測抗原的一抗是未偶聯的。取而代之的是，對一抗的宿主物種具有反應性的酶標二級抗體被用于檢測一抗-抗原復合物（間接檢測抗原）。將無色底物引入樣品，該底物與酶結合物反應，并產生可測量的副產物。根據底物的選擇，該副產物可以是比色的，化學發光的或熒光的。信號產生的大小與樣品中抗原的數量成正比。與直接ELISA相比，使用輔助檢測試劑具有明顯的優勢，即信號放大。

3.夾心法

夾心ELISA分析是最常用的ELISA形式。它需要使用匹配的抗體對，從而每種抗體對抗原上不同的非重疊表位具有特異性。首先將一種抗體，稱為捕獲抗體，包被在多孔微量滴定板的表面上，以促進靶抗原的固定。然后，第二種抗體（稱為檢測抗體）與捕獲抗體-抗原復合物結合。最后，添加對檢測抗體（而非捕獲抗體）具有特異性的酶標記的第二抗體偶聯物。