3.1.3 包被用抗原
用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三
大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養物等，須經提取純化才能作包被用。如
HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細菌和病毒抗原可以從其培養物中提取，蛋白
成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提取）。重組抗原
是抗原基因在質粒體中表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質粒體。重組抗原的
優點是除工程菌成份外，其他雜質少，而且無傳染性，但純化技術難度較大。以大腸桿菌
為質粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于ELISA，在反應中可出現假陽性，
因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點是能
用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不
能培養成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被
抗原大多為根據HCV的基因克隆表達而制備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重組抗原
如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應用。合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分
子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決
定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原
的包被一般需先使其與無關蛋白質如牛血清白蛋白質（BSA）等偶聯，借助于偶聯物與固
相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。應用多肽抗原的另一注意點為他僅能檢測與
其相應的抗體。一種蛋白質抗原往往含有多個不同的能引起抗體產生的決定簇，因此在受
檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發生反應。另外，某些微生物發生變異時往往發
生抗原結構變化，在這種情況下，用個別多肽抗原進行包被可引起其他抗體的漏檢。
3.1.4 包被用抗體
包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的
腹水或培養液。如免疫用抗原中含有雜質（即便是極微量的），在抗血清中將出現雜抗
體，必須除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。抗血清不能直接
用于包被，應先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經硫酸銨鹽
析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質不穩定。如需用高親和力的抗體包被以提
高試驗的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中
單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適
當稀釋后直接包被，必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意，一種單抗僅針對
一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。
3.1.5 包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據試驗的特點和材
料的性質而選定。抗體和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用
pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入
包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被
的最適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的
濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
3.1.6 封閉
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。抗原或抗體
包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相
關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手
續與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血
清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可
以高濃度使用（5%）。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶
粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需
封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活
性的，操作時洗滌徹底，不經封閉也可得到滿意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時，
因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業已起到了類似封閉劑的作用。
但在間接法測定中，封閉一般是不可少的（見2.2.2）。包被好的ELISA板干燥后放入密
封袋或錫袋中，在低溫可保存數月。
3.2 結合物
結合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中最關鍵的試劑。良好的結合物應該是
既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結合物中酶與抗體（或抗
原）之間有恰當的分子比例，在結合試劑中應盡量不含有或少含有游離的（未結合的）酶
或游離的抗體（或抗原）。此外，結合物尚要有良好的穩定性。
3.2.1 酶
用于ELISA的酶應符合以下要求：純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩
定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結合物后仍繼續保留它的活性部分和催化能力。最好
在受檢標本中不存在相同的酶。另外，它的相應底物易于制備和保存，價格低廉，有色產
物易于測定等。
在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷
酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化
酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
國產ELISA試劑一般都用HRP制備結合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分
子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一
種卟啉蛋白質。主酶無色糖蛋白在275nm波長處有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉
環，在403nm波長處有最高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度
數）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥?.0。
HRP除符合上述的ELISA中標記酶的要求外，更有價格低廉和性質較穩定的特點。值
得注意的是，在選用酶制劑時，除其純度RZ外，更應注意酶的活力。高純度的酶如保存不
當，活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后生成產物
量的測定進行試驗。
國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標記酶。常用的AP有兩個來源，分別
從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取
的AP分子量為80000，酶作用的最適合pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為
100000，最適pH為9.6。在ELISA中，AP系統的敏感度一般高于HRP系統，空白值也較
低，但AP價格昂貴，制備結合物所得率也較HRP低。
3.2.2 抗原和抗體
制備結合物時所用抗體一般 均為純度較高的IgG，以免在與酶聯結時其他雜蛋白的干
擾。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀
釋度進行反應，實驗結果本底淺淡。如用F(ab')2進行標記，則更可避免標本中RF的干擾。
在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。
3.2.3 結合物的制備
酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。
（1）戊二醛交聯法：戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質的氨基通過
它而聯結。堿性磷酸一般用此法進行標記。交聯方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊
二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應后即得酶標記抗體。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯。它具有操作簡便、有效（結合率達60%-70%）
和重復性好等優點。缺點是交聯反應是隨機的，酶與抗體交聯時分子間的比例不嚴格，結
合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。在兩步法中，
先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先
將抗體與戊二醛作用，再與酶聯結。兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比
例結合的，較一步法的酶結合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯的有效率較
一步法低。
（2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用
此法。反應時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基
形成Schiff氏堿而結合。酶標記物按克分子比例聯結，其最佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此
法簡便有效，一般認為是HRP最可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批
實驗結果不易重演。
按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上，結合物中混有
的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定，因經過徹底洗滌，游離酶可被除去，并
不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減
少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體
后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽
析法最為簡便，但效果并不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當數量的
游離抗體仍與酶結合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高
效液相層析法可將制備的結合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結合物而取
得最佳的分離效果，但費用較貴。
結合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當的工作濃度。使用過濃的結合
物，既不經濟，又可使本底增高；結合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須
對結合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個
低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節省。就酶標
抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反
應的最高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經
1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，將發生陽性反應。但在用于具體
的ELISA檢測中，酶標抗體的最適工作濃度受到固相載體的性質、包被抗原或抗體的純度
以及整個檢測系統如標本、反應溫度和時間等的影響，因此必須在實際測定條件下進
行"滴配"選擇能達到高敏感度的最大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。
3.2.4 結合物的保存
酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質，保存不當，極易失活。高濃度的結合物較
為穩定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且
使用時需經復溶，頗為不便。結合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的
冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結合物一般均按以上兩種形式供應，配以
稀釋液（見3.2.5）臨用時按標明的稀釋度稀釋成工作液。現在較先進的ELISA試劑盒均已
用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達6個月。由于蛋白
質濃度較低，結合物易失活，需加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和
防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉），以防止細菌生長。
3.2.5 結合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體
上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質（例如1%牛血清白蛋白），通過競爭以
抑制結合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，
如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時，血清標本需稀釋后進行測定，也
可應用這種稀釋液。
3.3 酶的底物
3.3.1 HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應，最具代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經酶
作用后成為有色的產物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-
phenylenediamine,OPD)、四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS
[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度
高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶
性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底
物應用液后更不穩定，須現配置現用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD
可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配
入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中
則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應
用液。
TMB經HRP作用后共產物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩定，可配成溶液試
劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等
優點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產物由藍色呈
黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。
另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，
經HRP作用后，產物顯熒光，可用熒光光度計測量。用于ELISA的優點為可加寬定
量測定的線性范圍。
HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物
(urea peroxide)。H2O2應用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩
定。試劑盒供應尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2
～8℃）可穩定1年。
3.3.2 AP的底物
AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底
物，可制成片劑，使用方便。產物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用
NaOH終止酶反應后，黃色可穩定一時間。
AP也有發熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用
顯色底物的比色法。
3.4 洗滌液
在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。
3.5 酶反應終止液
常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式
ELISA中一般采用2mol/L。
3.6 陽性對照品和陰性對照品
陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控
制品，同時也作為判斷結果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應盡量與
檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定，對照品最好也為人血清，因為正常人血
清在各種ELISA模式中可產生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國外試劑
盒中的對照品多以復鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離
子，使其中的纖維蛋白質凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對照品
須先行檢測，確定其中不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最
好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質，其中加入一定量的待
檢物質，此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱，在測定中得到
的吸光值與受檢標本吸光值比較，可對標本中受檢物質的量有一個粗略的估計。國外檢測
HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照
品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。
3.7 參考標準品
定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用
的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑
的緩沖液中。