ELISPOT技術原理及實驗方法

隨著酶聯免疫分析技術在醫學及生物學領域的廣泛應用，使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應答機制時以往常用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合，而不能確切的反映體內的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據ELISA技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內外廣泛應用，對探索自身免疫系統疾病發病機制具有重要意義。

ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統ELISA法，是定量ELISA技術的延伸和新的發展。兩者都是檢測細胞產生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：

1、ELISA通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。
2、ELISPOT通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數斑點或通過ELISPOT分析系統對斑點進行計數，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）
3、由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從 20萬-30萬 細胞中檢出 1個分泌該蛋白的細胞。
4、捕獲抗體為BD、R&D、Mabtach生產的高親和力、高特異性、低內毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。

ELISPOT檢測原理：ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術原理與ELISA相似。其實驗設計是在96微孔培養盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性（不含sodium azide、內毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細胞經適當分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當的抗原刺激，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養一段時間。一般而言，記憶型T細胞在受抗原刺激數小時后會開始分泌細胞激素，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素（Biotin）標記的二次抗體來標志，其后再以結合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質使其呈色，有反應作用的細胞會留下約10-20mm大小染色的斑點。

ELISPOT技術應用領域：移植中排斥反應的預測、疫苗發展、Th1/Th2分析、自身免疫病研究、腫瘤研究、過敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原決定簇圖譜分析、化合物和藥物免疫學反應的篩選等等。

ELISPOT實驗方法

現介紹檢測人現介紹檢測人IFNγ為例的PVDF  Eli-spot法，僅供參考。
試劑盒內容：PVDF96孔板，室溫保存；0.1ml捕獲抗體，4℃保存；0.1ml生物素標記檢測抗體，4℃保存；15ul親和素堿性磷酸酶標，4℃保存；0.25g牛血清白蛋白，4℃保存；0.25g脫脂乳，4℃保存；11ml底物緩沖液，4℃保存；11ml濃縮PBS（10X），室溫保存；11ml濃縮洗滌液（200x），室溫保存

自備材料/試劑： 細胞培養液，CO2孵育箱，70%酒精
直接的和間接的Eli-spot法

可在已包被抗體的孔中直接刺激細胞（直接法），或在24孔板或燒瓶中先刺激細胞，然后放入已包被的孔中（間接法）。使用哪種方法基于：1）檢測細胞的類型；2）希望得到的細胞量。如果只需少量的細胞因子生成細胞，使用直接法；如果細胞因子生成細胞較多，最好使用間接法。其它步驟一致。

刺激方法：建議用PMA和婁諾霉素刺激PBMC，使其產生IFNγ。

在培養液中稀釋PBMC（如：RPMI 1640加2mM谷氨酸鹽和10%加熱失活的小牛血清），其中含1ng/ml PMA和500ng/ml婁諾霉素（Sigma, Saint Louis, MO）。加2.104至5.104個細胞到抗體包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小時。其它的刺激劑孵育時間可能不同，基于細胞因子生成細胞的量，按不同情況作最佳選擇。

試劑的準備：1. 10ml磷酸緩沖鹽（PBS，10X）以90ml蒸餾水稀釋；2. 0.22g脫脂乳用11ml稀釋的PBS溶解，最終濃度為2%；3. 0.22gBSA溶解于22ml已稀釋的PBS，最終濃度為1%；4. 10ml濃縮洗滌液（200x）以1990ml蒸餾水稀釋；5. 10ul親和素堿性磷酸酶以10ml PBS-1%,BSA稀釋6. 7ml酒精以3ml蒸餾水稀釋，最終濃度為70%。

Eli-spot操作過程：
1.用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。
2.倒去酒精，用100ul PBS洗滌3次。
3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中，混合，每孔加100ul， 蓋上板蓋，4℃過夜。
4.倒去液體，100ul PBS洗滌一次。
5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS（見試劑準備），蓋上板蓋，室溫下孵育2小時。
6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
7.用100ul PBS洗滌一次。
8.每孔加入100ul細胞懸浮液（含適當量的細胞和相應濃度的刺激劑）。細胞可預先在體外接受刺激（間接Eli-spot）。蓋上標準的96孔板塑料板蓋，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時間（15-20小時）。這期間不要晃動或移動孔板。
9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。
11.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次。
12.于10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時30分。
13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。
14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時。
15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。
16.每孔加入100ul BCIP/NBT。
17.室溫下反應5-15分鐘。完全顯色后，將此液倒于相應的盤中。
18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點數。4℃下放置一夜，點會比較明顯。

此板在室溫下避光保存。

使用時應注意BCIP/NBT緩沖液是潛在的至癌物質，試驗時帶手套，使用后適當處理。對MAIPAN4510板，孵育時由于毛細作用，試劑滲入膜中，此液體難以洗去，因此導致背景增加。為了避免此情況，建議在步驟12時將板底移去，將膜倒轉，用蒸餾水流沖洗，同時用洗滌緩沖液按正常的步驟洗滌。在步驟14中，由于板底已移去，建議將MAIP4510板放于空的96孔板上，其后的步驟不變。