ExactivePlus：精確分子量定性和篩查定量的利器

——訪賽默飛世爾科技色譜質譜市場部經理王勇為博士

　　【導語】2008年第一代Exactive問世時，賽默飛的全球研發副總Ian Jardine說：“我們自問我們還能做些什么，去全面地發揮Orbitrap技術的潛力，使在常規毒理、環境和藥物研發領域的客戶能更方便地獲得這種技術？結論就是Exactive，它是一個真正的突破，能被應用于大量挑戰性的新領域中去。”4年過去了，伴隨著眾多全球用戶的好評，賽默飛發布了第二代臺式Orbitrap——Exactive Plus，所有關鍵性能都得以大幅提高。昆明質譜會上，本網記者有幸采訪到賽默飛色譜質譜市場部經理王勇為博士，他將為我們介紹更多關于這款產品激動人心的新性能……

賽默飛世爾科技色譜質譜市場部經理 王勇為博士（左）與賽默飛世爾科技GC/GCMS市場經理 蘆苓博士（右）

Exactive Plus臺式Orbitrap液質聯用儀

Exactive Plus臺式Orbitrap液質聯用儀

　　據王經理介紹，今年5月ASMS上發布的Exactive Plus，相比前一代的Exactive有了很多改進，大大提高了篩查能力，適用于未知物精確質量定性、多殘留分析、復雜基質中的高通量篩查等領域，其性能包括：

　　1）掃描速度提高了2倍，最快每秒可采集12張譜圖；

　　2）分辨率提高1.4倍，最高達140,000(FWHM)；

　　3）質量范圍擴展至m/z 6000，可直接用于大分子量多肽/抗體等蛋白的測定；

　　4）極性切換更快，在250ms內即可完成快速的極性切換；在35,000的高分辨率下，可在1秒鐘內采集一張正譜和一張負譜。

　　5）質量準確度：<1 ppm（內標），< 3 ppm（外標）

　　6）新的S型離子光學，使靈敏度提高3倍

　　7）采用C-Trap電荷檢測器（CTCD），增強了AGC的性能，進一步確保譜圖質量

　　8）數據相關的全離子碎裂（Data Dependent AIF）用于快速的化合物確認

　　9）可支持DART離子源接口用于篩查應用

　　10）對于預算暫時有限的客戶，未來在用戶現場，方便地升級為Q-Exactive

Exactive Plus系統內部結構

　　獲得這些更好的性能來自于技術上的幾大改進：

　　1）采用新型S型離子光學，使靈敏度提高。

　　2）采用新型的FT信號處理算法eFT，進一步提高了分辨率。

　　3）在C-Trap后面增加一個檢測器（CTCD），該檢測器可持續監測C-Trap中的離子數量，可獲得更高的譜圖質量，更好的定量結果。

　　4）增加HCD高能碰撞選件后，具備二級質譜的數據掃描模式AIF，使Exactive Plus可完成質譜全掃描，AIF掃描，數據依賴AIF，交替的全掃描/AIF掃描等多種方式。

　　王博士告訴我們，Exactive Plus具有高達140,000的超高分辨率，其優勢體現在三個方面：一是區分分子量差異的能力。當兩個化合物分子量非常接近時，分辨率高才能夠識別，例如當質譜分辨率達到50,000時，可以區分分子量僅僅相差0.02的化合物；二是針對生物樣本、食品等復雜基質樣品，高分辨質譜能夠提高選擇性，更徹底地排除基質干擾，因此在這里高分辨又起到了色譜分離的作用，降低了分析檢測中對色譜分離的要求。三是高分辨率是實現精確質量測定的一個基本條件，如果測定一個化合物的精確質量達到1－2個ppm，加上一些化學鍵規則的判斷，可以非常方便地獲得該化合物的元素組成，從而快速直接的定性。

　　本網收錄相關產品：Exactive plus臺式Orbitrap質譜儀

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Exactive Plus——精確分子量測量的基本工具

　　據王經理介紹，中國已經有很多從事有機合成研究工作的客戶，購置了Exactive，來幫助研究合成產物及其機理。而這些工作，以前他們需送到大型質譜中心，等待用FTICR-MS來完成測試。精確分子量測定是很多科研用戶最基本的需要，Exactive Plus是這類追求精確分子量測定的用戶的理想選擇。

　　Exactive Plus是臺式的Orbitrap，這決定了它操控非常簡單。不是質譜專業或分析化學專業的研究者們，都可以操控它并獲得極其“漂亮的”結果。比較起來，如果用TOF類儀器，會受到氣流波動、溫度變化、必須要內標等多種因素的影響，而Exactive Plus消除了這些影響，隨時可以獲得精確的分子量測定結果。如果用FTICR-MS，一般的實驗室是無力維護的，只有送到大型測試中心去測試，時間周期長，同時這些測試中心也需要對FTICR-MS投入高額的維護費用，對操作人的水平要求很高。

　　對于精確分子量測定，新一代的Exactive Plus還擴展了分子量測定的范圍到m/z 6000，這對于大分子量的聚合物、多肽、蛋白、抗體、生物藥物的測定帶來了極大的方便。除了配備ESI、APCI源，有些用戶還選擇配置了AP-MALDI源，大分子量樣品的測試就變得更為簡單。

Exactive Plus在高分子量下的測定：用AP-MALDI源，獲得5730 Da處牛胰島素的單電荷質譜圖，達到單同位素分辨，質量準確度為1.9 ppm

安裝了AP MALDI源的Exactive

 

Exactive Plus——開發篩查方法非常簡單

　　在篩查領域，Exactive Plus的應用領域很多，比如：藥物摻假、海關、法醫、食品安全、環境等。除了具有高分辨、精確質量測定的特性，還來源于Exactive Plus采集速度很快，正負極性切換速度快，可以適應于UHPLC、DART/ID CUBE等新型離子源快速篩查分析的要求，而且開發方法特別簡單。

Exactive Plus，在3.2秒內，可采集13張高分辨率的譜圖，質量準確度達5 ppm，全完適應于UHPLC的采集速度要求

　　關于篩查如何進行，以前本網曾有過報道：“用Q-Exactive篩查未知非法添加劑 三聚氰胺事件不再重演”，不需要做MS/MS，只需要把所有要監測的目標物的母離子精確質量，正/負離子化極性，輸入列表（inclusion list），然后讓Exactive/Exavtive Plus工作在全掃描狀態，來監測這些目標物即可，定量時可直接應用其高分辨一級質譜HRMS來定量。比如，用Exactive結合UHPLC，可在12分鐘內快速篩查510種ppb級的農殘（http://www.antpedia.com/corp/data-1170.html），并可獲得所有化合物良好的線性，其檢測下限滿足所有歐盟和日本的農殘標準。舉的這個篩查510種農殘的例子，并不是用Q-Exactive，而是用Exactive來完成的。在上文中也談到，使用Q-Exactive，可以在監測到母離子時，自動做MS/MS，從而滿足歐盟確認化合物的點數，達到對化合物的確認。從篩查角度來講，用Exactive即可很方便地完成篩查任務，不必考慮碰撞能量，不必調節很多參數，只需要把目標離子（或懷疑的目標離子）精確質量和極性輸入列表，運行一個全掃描就可以了。方法開發的簡便性、檢測的高通量、快速切換正負極性、直接用HRMS篩查和定量，使Exactive Plus非常適于做篩查工具。據王經理介紹，Exactive/Exactive Plus應用于篩查和定量已有多種應用，比如：食品安全中的農獸藥殘留、霉菌毒素和非法添加劑、環境污染物、興奮劑篩查、毒品和違禁藥物篩查、術后病人體內免疫抑制劑的快速篩查和定量等領域。

用Exactive快速篩查510種農殘的列表（部分）

用Exactive定量尿中14種benzodiazepines苯并二氮卓類鎮靜藥物

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Exactive Plus——篩查時同時做定性

　　即使現有的法規認為，確認還需要滿足歐盟點數的要求，但Exactive Plus的用戶完全可以用自己的方法來作化合物的定性。這其中包括：1）目標物的定性；2）一般未知物篩查（GUS）。

　　目標物定性時，Exactive Plus監測的參數包括如下幾項：目標物保留時間，同位素模式匹配，碎片檢索，數據庫檢索，其中碎片信息以及碎片譜圖都可以通過ExactFinder軟件進行數據庫檢索。

　　對于一般未知物篩查（GUS）而言，在目標物篩查后，可以自動對所有剩余的色譜峰進行GUS篩查，包括數據庫檢索，建立在同位素模式匹配基礎上的元素組成測定，譜圖檢索和internet檢索。前幾種檢索可通過ExactFinder進行，internet檢索可以通過在線的ChemSpider搜索引擎檢索。

QuEChERS方法提取的馬飼料樣品中的85種農藥殘留，用UHPLC-Exactive Plus分析的定性結果。采用ExactFinder軟件進行85種目標物的定性。液相時間：5分鐘，Exactive? Plus采用FS/ddAIF方式，全掃描分辨率：70,000，AIF分辨率：35,000

目標物定性后，對所有出現的剩余的峰進行GUS檢索，用同位素模式匹配到的Pencycuron戊菌隆，綠色框標記的是處于基質信號中的單同位素峰，Exactive Plus的高分辨能力確保區分單同位素信號峰和基質干擾峰

更多信息見：Increasing Speed of UHPLC-MS Analysis Using Single-stage Orbitrap Mass Spectrometer

　　在同UHPLC聯用進行高通量分析時，王經理還特別介紹了Exactive Plus新增加的數據依賴的AIF（ddAIF）功能：在與UHPLC聯用進行高通量時，色譜洗脫時間非常短，為了提高化合物的確認能力，最好利用HCD獲得分析物的碎片譜（AIF），但是在全掃描和AIF之間進行永久地切換會大幅降低采集速度，這時常需要去降低分辨率的設置。在新的Exactive Plus中增加了數據依賴的AIF（ddAIF）功能，在全掃描/數據依賴AIF（FS/ddAIF）模式下采集時，加入一個質量包括列表（列出目標物的質量），一旦檢測到該目標物質量超過設置的強度閾值，只觸發一次AIF掃描，這樣可以使采集速度基本保持在全掃描的速度下，更加匹配UHPLC的應用要求。大家知道，Exactive Plus的檢測原理是測定感應的電流信號，不需要做多張譜圖的平均，只需一張譜圖，就可得到高質量的信號。

在Exactive Plus上應用FS/ddAIF切換掃描模式，FS分辨率設置為70,000，ddAIF分辨率設置為35,000，只采集一張ddAIF譜圖

 

Exactive Plus——連接新型離子源的應用

　　新型離子源的應用近來很熱，美國FDA等法規部門已經采用DART連接Exactive來篩查幾百種農藥（http://www.antpedia.com/corp/data-642.html），在最新的ID-CUBE應用中，用戶可更方便地將樣品點在Open-Spot樣品卡片上，插在ID-CUBE源上快速檢測。

ID-CUBE源和Exactive聯用

將溶解后的樣品點在OpenSpot卡上（左圖），將膠囊中的樣品粉末直接點擊在Open Spot卡上

將OpenSpot卡插入ID-CUBE源即可運行

　　比如用ID-CUBE源連接Exactive，可對減肥藥中的違禁成分西布曲明進行快速篩查，并用HCD高能碰撞解離后產生的AIF（全離子碎片）譜進行指紋表征。在該實驗中，用Exactive外標法可快速獲得所有分析物<3ppm的精確質量，而從ESI源更換到ID-CUBE源只需3分鐘的時間，然后用不到1分鐘的時間來優化樣品的加熱條件。分析每張OpenSpot卡片只需要10秒鐘，不管是液體樣品還是固體粉末，都可得到一致性的快速分析結果。

用Exactive連接ID-CUBE源，檢測OpenSpot上的減肥藥中的西布取明，A）理論的化合物m/z 280.13265；B）直接分析點在OpenSpot上的粉末，質量準確度-2.2 ppm；C）將樣品粉末溶于5 uL乙腈點在OpenSpot卡上分析，質量準確度-2.7 ppm

用HCD高能碰撞解離后獲得AIF全離子碎片指紋，產生主要的碎片離子 m/z 125.01518和m/z 139.03071

 

Orbitrap平臺滿足用戶所有應用及預算

　　目前，賽默飛世爾科技Orbitrap整條產品線包括Exactive Plus、Q Exactive和Orbitarp Elite組合式高分辨質譜儀，能夠滿足用戶各種不同的應用需求及預算。

Orbitrap質譜平臺產品線

　　Exactive Plus屬于高分辨質譜的基礎設備，針對有精確分子量需求的用戶，進行有機物定性、篩查定量分析等，且操作非常簡便。從Exactive Plus升級到Q Exactive，在用戶現場即可完成。

　　Q Exactive具有 “Quanfirmation”流程化的新功能，可在一次分析中同時完成化合物的鑒定、定量和確證分析。高性能四極桿質量過濾器用于母離子選擇，可以獲得選擇性更好的MS/MS譜；在近期熱點的高難度的蛋白質組學定量分析方面也有杰出的表現。

　　Orbitarp Elite組合式高分辨質譜主要針對一些前沿學科的應用，以及新方法的探索。該質譜具備超過240,000 FWHM的杰出分辨能力，采用高場Orbitrap分析器，可綜合使用碰撞誘導解離(CID)，電子轉移解離(ETD)和HCD的碎片互補檢測技術，適用于自上而下蛋白質組學的研究。

　　談到幾種儀器的差別，王博士補充介紹到，Q Exactive和Orbitarp Elite這兩款高端質譜可以提供更多種的Workflow（工作流程），能夠針對更多特定領域用戶的要求。而在具有140,000的高分辨率后，Exactive Plus在需要各種高分辨率/精確分子量分析的領域，也都有出色表現。

　　Exactive在國內已有的用戶包括：從事中醫藥研究的院所、法醫毒理部門、有機合成的研究單位、CIQ等法規檢測部門等。王博士表示：希望能和更多國內的老師一起合作，建立一些解決食品/藥品/環境等問題的高分辨質譜方法。

　　最后王博士總結到：目前賽默飛世爾科技擁有三重四極桿、離子阱和高分辨軌道阱三大質譜平臺，為從定性到定量分析、從目標物到非目標物分析，提供全方位的工作流程解決方案，能夠被廣泛應用于生命科學、藥物研發、食品安全、臨床、法醫檢驗等，幫助解決實驗室各種具有挑戰性的分析問題。