FISH技術基本實驗

70%乙醇 SSC 磷酸鹽緩沖溶液（PBS) Hemo-De清理試劑 蛋白酶溶液

水浴鍋 增濕器 玻片

一、制備培養的中期細胞標本

1.在一個獨立小室里放置一個水浴鍋和一臺增濕器。濕度應大約50%，如果房間濕度計顯示低于45%，則應使用加濕器。

2.預熱水浴鍋至67℃±2℃，在水浴鍋中央放置試管架以使碰不到水浴鍋邊緣，整個操作過程保持水位剛好在試管架頂端之下。

3.用Carnoy固定液調整細胞懸液的濃度，使懸液輕度混濁即可

4.用70%乙醇清洗載玻片的兩面，用無塵紙將玻片擦干。

5.將清洗過的玻片浸在一缸水中，傾斜載玻片使水均勻覆蓋在片子上表面。

6.立刻將片子移至水浴鍋上方，拿一支2?4in(1in=2.54cm)的巴斯德吸管，在片子上方沿片子長邊滴3或4滴細胞懸液。

7.將片子放置在水浴中試管架的頂端，有標本面向上，讓片子干燥5?10min.

8.將片子拿開，在相差顯微鏡下觀察，必要時調整滴片條件。

二、使用可調節細胞遺傳干燥器制備中期染色體標本

1.打開溫差電偶真空計，將溫度設定為22℃和相對濕度設定為44%，并使之達到穩定狀態。

2.用Camoy固定液調整細胞濃度，使懸液呈微混濁狀。

3.用70%乙醇清洗載玻片兩面，并用無塵紙擦干，將片子放置在溫差電偶真空計的內表面。

4.握住一支2?4in巴斯德吸管，在片子正上方沿著片子的長邊滴3或4滴細胞懸液。

5.觀察懸液干燥的情形。懸液在45?60s內干燥的情況下制備的標本質量一般較好。

6.在相差顯微鏡下觀察，必要時調整滴片條件。

三、制備未經過培養的標本

1.小心重懸固定的細胞。

2.每個雜交區域滴15?20uL細胞懸液（通常每張片子滴兩個區域）

3.氣干標本。

4.在相差顯微鏡下檢驗細胞密度，如有必要重復2和3步。

5.過夜老化或在73℃的2\SSC溶液中保溫2min。

四、制備尿道上皮細胞標本

1小心重懸細胞并分別滴3uL、10uL和30uL懸液在加蓋載玻片的3個孔中。

2.氣干標本。

3.確定哪個樣品的細胞密度最佳，即擁有足夠數量的非重疊細胞。

4.在相差顯微鏡下面觀察細胞密度，并選擇合適的孔進行雜交。

5.過夜老化或在73℃的2XSSC溶液中保溫2min。

五、新鮮細胞的預處理

1.將標本在73℃的2XSSC中浸泡2min。

2.將標本在37℃的胃蛋白酶工作液中浸泡10min

3.將標本在室溫的PBS中洗5min。

4.室溫下將標本在處理后固定液中放置5min。

5.將標本在室溫的PBS中洗5min。

6.將標本自然風干。

7.將標本在70%的乙醇中室溫下浸lmin。

8.將標本在85%的乙醇中室溫下浸lmin。

9.將標本在100%的乙醇中室溫下浸lmin。

10.可以進行標本變性。

六、石蠟標本的預處理

1.用鉆石筆標出待雜交的石蠟區域。

2.室溫下將標本在Hemo-De清理試劑中浸lOmin。

3.將標本在Hemo-De清理試劑中重復洗2次，每次都使用新鮮的Hemo-De清理試劑。

4.室溫下，將標本在100%乙醇中脫水5min。

5.換新的乙醇重復步驟4。

6.將標本自然風干或將片子在45?50℃的片子加熱板上放置2?5min。

7.將標本在0.2mol/L HCl中浸20min。

8.將標本在純水中浸3min。

9.將標本在洗脫緩沖液中浸3min。

10.將標本在80℃預處理液中浸30min。

11.將標本在純水中浸1min。

12.將標本在洗脫緩沖液中浸5min。

13.重復在洗脫緩沖液中清洗步驟。

14.用紙巾從載玻片邊緣蘸去多余的洗脫緩沖液。

15.將標本在37℃的蛋白酶溶液中浸泡10min。

16.將標本在洗脫緩沖液中浸5min。

17.重復在洗脫緩沖液中清洗步驟。

18.將標本在45?50℃的標本電熱板上干燥2?5min。

19.將標本在中性福爾馬林緩沖液中室溫浸泡10min。

20.將標本在洗脫緩沖液中浸5min。

21.重復在洗脫緩沖液中清洗步驟。

22.將標本在45?50℃的標本電熱板上干燥2?5min。

23.可繼續進行雜交操作程序。

七、雜交和洗脫。

一定要協調好準備探針的時間和標本變性時間，以便同時完成以備雜交。

1.將標本在73℃變性液中浸泡5min。一個染缸內一次最多變性4?6張載玻片。

2.將標本浸在室溫的70%乙醇中lmin。

3.將標本浸在室溫的85%乙醇中1min。

4.將標本浸在室溫的100%乙醇中1min。

5.用吸水紙從載玻片的邊緣吸取多余的乙醇并用紙巾將玻片背面擦干。

6.將探針分裝到一個微量離心管中并蓋緊，將探針在73℃水浴中變性5min。

7.在標本上的目標區域加3?10μL(根據樣品區域而定）探針混合液

8.立刻在探針上覆蓋以22mmX22mm或一個12mm圓形蓋玻片使探針均勻分布。

9.用橡皮泥封住蓋玻片周邊。

10.將標本放在37℃預熱的濕盒中。

11.將雜交標本在37℃保溫過夜（14?18h)。

12.用鑷子輕輕撕除封片膠。

13.室溫下，將標本浸在雜交后洗脫緩沖液中并洗掉蓋玻片。

14.從載玻片的一端吸除過量的液體。

15.將載玻片在73℃的雜交后洗脫緩沖液中浸洗2min。每個染缸一次不得洗脫超過4?6張非福爾馬林固定的標本，在2XSSC/0.1%NP-40中室溫浸洗1min。

16.取出片子，將片子垂直放置于暗處風干。

17.加10jaLDAPI復染液到目標區域并蓋上22mmX22mm蓋玻片。

18.雜交后標本置于暗處保存。不使用時于-20℃保存。

八、間期細胞的信號計數

使用下列各項標準評估片子是否合適。

1.探針信號強度：信號應該是明亮、清晰和易于評估。信號應該是緊密的橢圓形或線狀、彌散的橢圓形。

2.背景：背景應該呈深暗或黑色，很少有熒光顆粒或是霧狀

3.靶信號的識別：使用指定的濾光片。調整焦距，而且要熟悉靶信號和背景噪聲(碎片）的大小和形狀。

4.使用40X目鏡，掃描一些區域估計細胞類型的異質性。選擇一個核分布均勻的區域，避幵靶信號弱的區域。

5.使用63X或100X目鏡，開始分析選定區域左上象限，并從左向右掃描，依照指導原則在每個清晰可辨的間期細胞核邊界內計數信號。

6.上下調節焦距找到核內所有信號。

7.大小相同，相距小于或等于單個信號直徑可計為兩個信號。

8.不要對沒有信號或當使用兩種或更多不同熒光素只有一種顏色信號的核進行計數。只記人那些每種顏色有一個或多個FISH信號的核。

1.雖然煮沸TE探針溶液可進行變性，但為了更好地保持組織、細胞和染色體的形態應采用更溫和的一些方法。染色質內DNA變性程度高低還依賴于對：Tm值這一參數的充分理解，Tm被定義為50%的DNA呈單鏈狀態的溫度。Tm值的大小依賴于GC含量、單價陽離子濃度和雙鏈長度樣品變性溫度須遠遠超過Tm值，使近100%的DNA呈單鏈狀態，典型的變性條件是在70?75°C的50%?55%甲酰胺/2X SSC溶液。通常探針和樣品同時在玻片上變性，這就提供了快速形成雜合雙鏈更加有利的動力學條件。如果變性條件遠遠髙于這些條件，可產生廣泛的斑狀雜交式樣，這是緊密的DNA-組蛋白結構解螺旋的結果。充分固定可在某種程度上避免此種狀況。相反，如果DNA鏈變性不充分，就會產生少量或無雜交信號的結果。

2.封閉DNA的性質不同取決于探針的復雜程度。高重復序列DNA探針，如著絲粒或近著絲粒DNA須在10?100倍的過量人類基因組總DNA存在下進行雜交。如果探針包含某染色體臂特定區域的單一序列，須在含相似量的過量高度重復DNA的情況下進行雜交；這種高度重復DNA，即Cot-1DNA，它由高度重復的a序列和中度重復序列（如Aki重復序列家族）組成Alu重復序列家族存在于所有染色體實際上也存在于所有用來制備探針的基因組DNA片段中。

3.雜交時間的長短由探針序列的復雜性而定。由相當大一部分為單一序列的探針通常需要37℃過夜，而包含著絲粒或著絲粒周邊圍衛星序列的探針只需要在37?42°C雜交幾個小時。為了區分出極相關的重復序列可以稍稍改變雜交溫度，不過可通過高嚴緊度洗脫有效消除交叉雜交。石蠟包埋的標本使用高鹽洗脫液即可達到與非石蠟包埋的標本在較高嚴緊度洗脫相似的特異性，這是因為福爾馬林固定標本的探針與靶雜交體的熔點較低，原因可能在于降解使靶序列太短或雜交區域蛋白質的穩定存在使雜交體不穩定。