Fe（II）-EDTA 能夠催化 RNA 或 DNA 的斷裂，是 RNase 保護分析的一個補充方法，其優點是很少或沒有堿基序列的特異性，其沿著整個長度的 RNA 或 DNA 鏈的剪切幾乎是一致的，它可被用于解釋一些 RNA 的較高級的折疊方式。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。
| 實驗方法原理 | Fe（II）-EDTA 能夠催化 RNA 或 DNA 的斷裂，是 RNase 保護分析的一個補充方法，其優點是很少或沒有堿基序列的特異性，其沿著整個長度的 RNA 或 DNA 鏈的剪切幾乎是一致的，它可被用于解釋一些 RNA 的較高級的折疊方式。 |
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| 試劑、試劑盒 | RNA洗脫緩沖液退火緩沖液硫脲抗壞血酸鈉 |
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| 儀器、耗材 | 水浴垂直電泳裝置暗片盒 |
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| 實驗步驟 | 一、材料與設備
1. 水浴。
2. 垂直電泳裝置。
3. 暗片盒。
4. RNA 洗脫緩沖液：80% 甲酰胺，40 mmol/L PIPES，1 mmol/L EDTA，0.4 mol/L NaCL。
5. 退火緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 )，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2。
6. (NH4)2Fe(SO4)2 溶液：10 mmol/L (NH4)2Fe(SO4)2 ( Sigma 公司），20 mmol/L EDTA，用前搖勻。
7. 100 mmol/L 硫脲。
8. 0.9% H2O2。
9. 10 mmoI/L 抗壞血酸鈉。
二、操作方法
1. 制備 RNA：通過 PAGE 純化末端標記的 RNA，用 RNA 洗脫緩沖液抽提含有 RNA 的凝膠條塊，再用乙醇沉淀 RNA。
2. 退火：以使 RNA 形成適當的結構。用 50 μl 的退火緩沖液將 RNA 濃度調整為 25 mmol/L，95℃ 加熱 2 min后，置于冰上 1 h。
3. 反應：將 7 μl 的 RNA、1 μl 10 mmol/L (NH4)2Fe(SO4)2 溶液，1 μl 10 mmol/L 抗壞血酸鈉和 0.9% 的 H2O2 混合，于 20°C 溫育 10 min 后加入 1 μl 100 mmol/L 硫脲以終止自由基反應。
4. 檢測：用含 8 mol/L 尿素的 10%~15% PAGE 和放射自顯影對切割產物進行分析。
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