| 實驗步驟 |
第一階段 用熒光染料標記蛋白質
材料
緩沖液和溶液
將儲備溶液稀釋到適當的濃度。
用 NaOH 調節的 N-二羥乙基甘氨酸（0.1mol/L,PH7.5)
用 NaOH 調節的 N-二羥乙基甘氨酸（1mol/L,pH9.0~9.5)
消化緩沖液
20 mmol/L 磷酸鈉
10 mmol/LEDTA
20 mmol/L 半胱氨酸/HCl 緩沖液（pH7.0)
N,N-二甲基甲酰胺（DMF)
在存儲容器中加入約
1/3 體積的吸濕性樹脂用于干燥 DMF。例如，可以始終將 AG501-X8 混合床樹脂 (Bio-Rad) 放在 DMF 原料瓶中。如果對
DMF
的完整性有任何疑問時，則可以另外加入一些新鮮樹脂，或者用新鮮樹脂替換老樹脂。這樣的操作是考慮到會出現標記蛋白質能否達到期望比例的問題，因為標記反應時水的存在（可能來源于
DMF) 會競爭游離染料。
含有 10 mmol/LEDTA(pH7.0) 的磷酸鈉（20 mmol/L)
磷酸鹽緩沖溶液（PBS)
TE(pH7.0)
酶和緩沖液
固定在瓊脂糖顆粒上的木瓜蛋白酶（分散在消化緩沖液中的 50% 混懸液；Sigma)
標記化合物
Cy3 和 Cy5 OSu 單功能硫代吲哚花菁琥珀酰亞胺酯（Amersham)
硫代吲哚花菁（cy)
的琥珀酰亞胺酯染料共價結合到游離氨基（賴氨酸側鏈α-氨基末端或 e-氨基）。Cy
染料以凍干態使用，所有情況下保證其處于干燥狀態以避免與水反應。由于批與批之間可能存在差異，每一瓶中染料的量必須單獨測定。在這里所舉的例子中，用俄勒岡綠的琥珀酰亞胺酯（分子探針）來標記
MC5 PKCα抗體。
抗體
待標記的純化抗體，如 MC5(單克隆）或
T250(多克隆），或蛋白質標記反應必須在沒有氨基的緩沖液中進行。許多商用抗體制品中添加了含有可能競爭 Cy
染料的游離氨基添加劑（如牛血清白蛋白或明膠）。也有許多供應商可以根據要求提供不含這些化合物的抗體制品，這種情況下可以要求提供溶于磷酸鹽緩沖溶液中、濃度為
lmg/ml 的樣品。
凝膠
SDS-聚丙烯酰胺凝膠
制備 SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白時，請參考附錄 8
專用裝置
Centricon 濃縮器：YM10,YM30,YM100(分別切割 10、30、100kDa 大小的分子；Amicon)
凝膠過濾/分子大小排阻色譜柱（預裝一次性 Econo-Pac 10DG;Bio-Rad)
蛋白 A-瓊脂糖凝膠柱（Econo-Pac 的 2 ml 柱；Bio-Rad)
用裝料體積 20 倍的 20 mmol/L 磷酸鈉沖洗柱來使柱平衡。推薦用蛋白 G 來純化小鼠抗體。
UV/可見吸收分光光度計
附加試劑
本方案中的第 7 步需要測定蛋白質濃度的試劑（如 Bradford 分析試劑）（Spector et al.1998，第 56 章）。
方法
Fab 片段的制備與純化
1. 采用像 Centricon YM100 的一次性濃縮器，以離心的方法使抗體在含 10 mmol/L EDTA 的 20 mmol/L 磷酸鈉溶液（pH7.0) 中的濃度濃縮至 15~20 mg/ml。
2. 向 250ul 濃縮的抗體制品（約 4~5 mg) 中加入 500ul 消化緩沖液和 500ul 固定在瓊脂糖顆粒上的 50% 木瓜蛋白酶混懸液（分散在消化緩沖液中）。37°C 振搖（振蕩孵化器中，300~400r/min)6~10 h 進行消化。
重要：消化過度（如超過
16 h) 將導致 Fab 片段裂解成較小的多肽。因此建議進行預試驗，毎隔1h 取少量的消化液（約 5ul) 采用還原性 SDS
聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分桁，在還原條件下，lgG 的重鏈和輕鏈會像 50kDa 和 25kDa 的多肽一樣遷移。經木瓜蛋白酶消化的抗體按約
25kDa 大小的分子遷移。
3. 采用蛋白質 A-瓊脂糖凝膠柱從 Fc 部分和未經消化的抗體中純化 Fab 片段。將消化混合物加到平衡過的柱上，并按每份 1 ml 立即開始收集流過液部分。
蛋白 A 將與抗體的 Fc 部分結合，因此可以從消化混合物中除去全抗體和 Fc 部分，獲得的流過液就僅僅含有 Fab 片段。注意！IgG 分子的許多亞類不與蛋白 A 結合。當需要制備小鼠單克隆抗體的 Fab 片段時，使用蛋白 G。
4. 為了鑒定哪些流過液部分中含有純化的 Fab 片段，測定每一部分的 OD280, 收集并合并 Fab 濃度最高的三個或四個組分。
一般來講，可以在大約 3~4 個組分中發現 Fab 片段。
5. 使用 Centricon YM100 柱（截流值 10kDa;Amicon) 離心將合并的組分濃縮至體積 0.5 ml 以下。
6. 將樣品加到 PBS 平衡的低分子質量（6kDa 以下）凝膠濾過層析柱上，用 PBS 洗脫 Fab 片段（按照產品說明進行)。
為了標記 Fab 片段，必須將它們交換到不含游離氨基（如消化液中必須除去游離半胱氨酸）的緩沖液中。
7. 洗脫后，采用 Centricon 濃縮器使 Fab 片段濃縮后，測定蛋白質濃度。加入 1/10 體積的 1mol/L N-二羥乙基甘氨酸（pH9.0)
采用 Bradford 分析法測定 IgG 濃度，以牛血淸白蛋白作為標準品，并乘以系數 2。
濃縮的 Fab 制品現在就可以準備進行熒光硫代吲哚花菁染料標記。
染料制備
8. 將各瓶凍干染料中的內容物重新混懸于 20ul 的干 N,N-二甲基甲酰胺中，得到濃度約 10 mmol/L 的 Cy 溶液。
9. 將 1ul 染料混合物用 PBS 按 1:10000 稀釋，并由可見吸收峰計算染料濃度。
Cy3 和 Cy5 在 554nm 和 650nm 的吸光系數分別為 150000L?nmol-1 和 250000L?nmol-1。
染料結合
10. 標記蛋白質時，將其混懸于不含游離氨基的緩沖液中。如果蛋白質溶液不是在一種適當的緩沖液中，則按上述第 6~7 步進行操作。
蛋白質如果因穩定性的考慮必須采用持定的緩沖系統，則凝膠過濾系統也采用該緩沖液平衡。注意緩沖成分中不應含有游離氨基或抑制標記反應的成分。值得注意的是，像二硫蘇糖醇、β-疏基乙醇等還原劑對標記反應有干擾。然而，如果為了保持生理/蛋白質功能而必須添加還原劑時，β-疏基乙醇因為干擾較低，因此是首選的還原劑。在
0.1mol/L N-二羥乙基甘氨酸（PH9.0) 中進行標記以前，T(P)250 和 MC5 均需置換到 PBS 中。
建議在標記反應過程中保持堿性 pH 條作（同時保持蛋白質的完整性），以便使賴氨酸的ε-氨基增加質子解離性并因而能有效地結合。
11. 蛋白質樣品（抗體、Fab 片段或蛋白質）與 10~40 倍過量摩爾數的 Cy3 在室溫反應 30 min(按第 8~9 步所描述的進行)。將染料非常緩慢地加入到用移液管尖頭攪拌的溶液中（小心操作以避免染料直接與微離心管接觸)。
為了避免蛋白質因為 DMF 而變性，所加人的 Cy3/DMF 體積必須不超過總體積的 10%。
最佳的過量摩爾數以及反應時間都是根據經驗來確定的。標記的目標是能使毎一個蛋白質分子與
1~3
個染料分子結合（對于標記比例標準的討論，請參閱本方案的導言部分)。對于不同的蛋白質或抗體，其標記水平有很大的變化。如果最終的標記率太低，可能可以重新標記抗體。像
T(p)250 和 MC5 等抗體，已經成功地用超過 40 倍過量摩爾數的染料進行標記。
12. 加入最終濃度為10mmol/L 的含有游離氨基的緩沖液，如 Tris 等來終止標記反應。
13. 采用凝膠過濾柱系統（10DG,Bic-Rad) 來交換緩沖液以除去多余的未反應染料，并將蛋由質洗脫至 PBS 中。
a. 用三倍量填料體積的 PBS 或其他選定的緩沖液（約 30 ml) 平衡柱系統。
b. 為了達到最大分離，將標記反應的混合物直接加到樹脂上，并注意使它的體積越小越好。
c. 用 2.5 ml 緩沖液（上空體積約為 3.3 ml) 清洗柱并廢棄洗脫液。
d. 另外加入 2 ml 緩沖液并收集可見蛋白質組分，將剩余物丟棄。標記產物將跑在前沿，并可以肉眼觀察到，而游離染料從柱上洗脫較慢。
14. 采用 Centricon 濃縮器（可以截流適當大小的分子）再次對標記蛋白質進行濃縮。
15. 采用 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析標記產物，以便驗證蛋白質是否成功地被標記。產物經電泳分離后，直接用紫外透照儀（302nm) 檢査凝膠上的可見標記產物。
熒光帶遷移至蛋白質的預期分于質量部位。在電泳遷移的前沿沒有游離染料的熒光；
對于大多數染料，在 302nm 的紫外激發是較好的選擇。如果對凝膠照射時不能看到帶，則可以考慮采用更短波長的激發光。
16. 標記反應以后，采用下述公式計算標記率：
Aλ X M / [ ( A280-? X Aλ ) X ελ ]
式中 Aλ是染料在其最大吸收波長λ處的吸收度，A280 是蛋白質在 280nm 的吸收度，M 是以 kDa 為單位的蛋白質分子質量，ελ是染料在波長 λ 處的摩爾消光系數，以 L?mmol-1?cm-1 為單位。公式以染料在 280nm 處的吸收進行校正。系數?是染料在 280nm 和最大可見吸收波校λ的吸收度比值。例如，Cy3 標記抗體的標記率公式就變為：
A554 X 170 / [ ( A280 - 0.05 X A554 ) X 150 ]
為了驗證染料的結合是否會影響
Fab,
整個抗體或者蛋白質的生理功能，將標記產物與相應的未標記成分進行持異性活性比較。特異性活性包括催化活性或蛋白質結合活性。這些蛋白質結合分析可以采用瓊脂糖固定的肽配體或磷酸酪氨酸顆粒來進行。這種結合活性測試的標準探作規程可以參閱《抗體技術實驗指南
(Using Antibodies)》（Harlow and Lane1999)。(該書中譯版已由科學出版社 2002 年 9
月出版。------編者注）
第二階段 FLIM.FRET 分析的細胞制備
材料
緩沖液和溶液
將貯存溶液稀釋到適當的濃度。
明膠溶液（0.1%)
可選，請參見第 1 步。
將 0.5 g 明膠（Porcine,Sigma) 溶于 500 ml 1X 麻酸鹽緩沖液液中。高壓滅菌。
磷酸鹽緩沖溶液（PBS)
聚-L-賴氨酸
可選，請參見第 1 步。
可以從 Sigma 購得 0.1%(m/V) 水溶液，使用前用水按 1:10 稀釋。
核酸和寡核苷酸
載有探針的質粒 DNA
編碼了目標蛋白質的 GFP 融合載體（CLONTECH)。
培養基
CO2-非依賴性成像培養基
這種低背景的熒光培養基可以從
Life Technologies 購得，或者采用經 Dulbecco 修改 Esgle's
的培養基的標準組成中除去下列成分以后的培養基：pH 標記物酚紅、青霉素、鏈霉素、葉酸以及維生素 B2。使用前采用以 NaOH 調至 pH7.4
的無菌 HEPES(終濃度為 50 mmol/L) 來補充培養基。
成像培養綦必須不含有自動熒光成分。
專用裝置
組織培養板（6 孔或 12 孔）（Nunc), 或者
玻璃底組織培養皿（35 mm,MatTek Corporation)，或者
腔室載玻片或腔室蓋破片（Labtek,Nunc)。
附加試劑
本方案中的第 2 步需要用第 16 章中介紹的轉染方法所需的試劑。
細胞和組織
進行轉染的細胞株（貼壁或懸浮培養）
除了考慮細胞株是否適合所研究的系統以外，選擇細胞類型惟一需要考慮的就是通過—些方法可以方便地將它們固定（請參見第 1 步說明）。
方法
1. 將細胞移植到適當的表面進行顯微觀察：
對于活細胞制品：將細胞鋪到玻璃底平皿或腔室蓋玻片中。
對于轉染后固定的細胞制品：將細胞移植到置于 6 孔或 12 孔組織培養皿中的玻璃蓋玻片上。
容器的最終選擇取決于細抱在轉染后是否需要微注射；如果需要. 則應根據針頭操作需要來考慮器皿的形狀和剩余空間。
對于懸浮細胞，固化柯以更方便地使用像明膠（0.1%,m/V,PBS;
高壓滅菌）或聚 L-賴 氨酸（0.01% 水溶液，m/V) 等培養基。兩種情況下, 均采用所選擇的培養基覆蓋小孔、蓋片或者蓋玻片約 30
min
來對上述材料表面進行包覆，再吸出過剩的培養基，然后，將細胞直接移植到培養基裏蓋的表面。在轉染操作過程中，細胞也可以保持在混懸液中，到成像前再立即固化細胞一旦固化后，就可以進行微注射了。
將細胞按-定的密度涂板，使約 40% 的細胞在第二天可以融合。
2. 采用第 16 章中所介紹的任意一種轉染方法，用編碼了 GFP 標記的目標蛋白的質粒轉染細胞。
3. 轉染細胞在適當條件下孵化 16~24 h, 以使細胞表達目標蛋白。
在有些情況下，必須梢確控制蛋白質表達水平。此時，建議在進行 FLIM 測定前先優化轉染效率以及表達周期，可以采用調整的增強子來促進蛋白質的表達（請參見第 17 章)，或者采用核微注射來替代轉染（請參見本方案結束處的“替代方案，活細胞的微注射”）。
4. 表達了目標蛋白質的細胞的鑒別。
5.(可選）如果實驗設計允許, 選擇第 6 步后面的替代方案，即微注射 (用于活細胞）或者固定和染色 (用于固定細胞)，中的一種方法來導入另一探針 (如: 標記蛋白）。
6. 在進行顯微實驗以前，立即用 CO2 非依賴性成像培養基（市售培養基或按材料項介紹的方法調整的經 Dulbecco 修改的 Eagle’s 培養基) 替換培養基。
在實驗設計中，如果在有關的處理前需要將細胞血清饑餓，則在成像前按所介紹的時間段讓細跑饑餓。但是, 如果細胞在缺乏血漿時會發生凋亡的話，就應在饑餓期間將細胞置于 0.5% 的胎牛血淸中，然后在成像前立即用無血淸培養基替換。
第三階段 FLIM·FRET 測量
材料
專用裝置
放大器（ENI403LA 或 Intra-actionPA-4)
氬激光（Coherent,Innova70C)
寬帶絕緣反射鏡（2 個；Newport Corporation)
檢測器
MCP，HamamatsuC5825 或 LaVision Picostat HR
CCD, 配備 Kodak KAF 1400 芯片的 Photometries Quamix
濾光器
GFP,OG(Q495LP,HQ5lO/20;Chroma)
Cy3(HQ545/30,Q565LP,HQ610/75;Chroma)
單面鍍銀反射鏡（Zeiss)
曲鏡座（2 個)，透鏡支架（2 個)，標竿（5 個），以及后支架（5 個）（Newport)
倒置顯微鏡（Zeiss 135TV)
IPLab Spectrum(Signal Analytics)
可變光圈（Comar)
透鏡（分別為焦距 12 和 7.6 cm、焦距 2.5 和 3.8 cm;Newport)
水銀燈（100 W Zeiss;HBO 100 AttoArc)
Multimode fiber step-indexed 1-mm core(步長指數 1 mm 內核的多態纖維）
(Newport)
油接物鏡（100X/1.4NA;ZeissFluar)
光學操作臺（2X1m;TMC)
Power meter 和 head (Ophir,Nova Display 和 2A-SH)
配備 PCI-GPIB 卡（National Instruments) 的 Power PC(Macintosh)
快門（高速)Vincent Associates,UniblitzVS25)
快門啟動器（Vincent Associates,UniblitzVS25)
駐波聲-光調制器（acousto-optic modulator,AOM)(Intra-action,80MHz)
倍頻合成器（IFR2023)
可變密度濾光器滑輪（Laser Components)
水循環冷卻裝置（Grant)
細胞和組織
按第二階段所介紹的方法制備表達了蛋白質探針的細胞（活的或固定的)
方法
1. 調節波長選擇棱鏡，選定 488nm 的氬激光為激發波長。采用激光背面的控制旋鈕微量調整高反射鏡面的位置來優化輸出功率。
2. 設定頻率合成器來啟動 AOM 至共振頻率約為 40MHz(對于這里所介紹的實驗，采用的啟動頻率為 40.112MHz)。這使得激光束以兩倍于驅動頻率（80.224MHz) 的強度振動。
3. 通過調節入射角的角度和用光度計監測非衍射零級光的強度來優化 AOM 的衍射以及調制強度。在優化的衍射角度（達到相應的最大衍射）時零級光的輸出功率最小。
4.
開啟 MCP 和 CCD。將光陰極電壓的基底值設為-2V, 并調整增益以匹配 CCD
的滿動力范圍。這取決于樣品的熒光強度，并需要憑經驗來確定。最理想的是，使增益值盡可能小以降低噪聲。通常將 Hamamatsu C5825
的增益值設定為 1, 而 Photometrics Quantix CCD 的增益值設定為 3。將 CCD 的示值讀數設定為 2X2 柵格。
5. 將主頻率合成器驅動 MCP 的頻率設定為驅動 AOM 頻率的兩倍（對于上面所舉的例子即為 80.224MHz)。
6. 選擇最合適的物鏡來進行實驗。在本例中使用的是 Zeiss Fluar 100x/1.4NA 油物鏡。
7. 為了得到零級壽命參照圖像，從強掃描開始每相隔 22.5°記錄整個一周 16 張相位依賴性圖像（例如：將一小片鋁箔置于蓋玻片或玻璃底平皿的成像表面)。
a. 將熒光濾器部件改為單面鍍銀反射鏡，并用可變強度濾光滑輪將外來光的強度調至最小值。將聚焦點調整至鋁箔表面。
注意：當設置鋁箔成像時，在將外來光源的強度調至最小值以前，千萬注意不要直接用肉眼看顯微鏡。
b. 照一張曝光時間約為 100ms 的鋁箔圖像。這張圖像是用來選擇 ROI 并估計所需的最佳曝光時間的。因為此時主頻率合成器的相位可能不是最大的，為了避免檢測器的飽和，應該選擇可以生成約 1000 個計數的曝光時間。
c. 每相隔 22.5°記錄整個一周 16 張相圖，測定圖像系列中達到最大強度時的相位，并在主頻率合成器上重新將該相位設為 0 度。
d. 記錄鋁箔另一周十六張相圖并記為零級壽命參照圖像。
當進行壽命成像時，我們建議隨時監測相穩定性。我們的裝置一小時內相位可以穩定在 0.3°以內。對于我們的裝置，每小時記錄并保存一組參照鋁箔像序列。
8. 將外來激發光源保存為最大（利用可變強度濾光滑輪）；這樣系統就已經準備好可以采集細胞的圖像資料。
9. 用 GFP 濾光器設置（分光器：Q495LP, 激發裝置：HQ510/20) 獲取一張供體圖像。曝光時間設定為能達到 75% 的 CCD 動態范圍（對于 12 位 CCD 為 3000 個計數)。在圖像中選擇感興趣的區域來測定熒光壽命。
10. 制備供體熒光壽命圖譜：
a. 獲取兩個鄰近的、一個正相另一個反相循環的 16 張相位依賴性圖像（間隔 45°相位）系列來校正相淬滅。按第 9 步的方法優化每一張相圖的曝光時間設置。
b. 在沒有樣品照射的情況下獲取另一張圖像。將這張去除背景的圖像從系列的所有相圖中提取出來，然后將正相和反相循環中每一對相同相位的圖像進行一級加和來修正供體的淬滅。
c. 由這些資料以及零級壽命參照圖像（鋁箔），按照本方案導言部分關于圖像操作的討論中所介紹的方法來計算供體熒光壽命圖譜。
11.
記錄受體的圖像，然后將照明光源改為 100W 水銀燈（Zeiss Attoarc) 來淬滅受體。將 Cy3
濾光部件（激發裝置：HQ545/30; 分光器：Q565LP; 發射裝置：HQ610/75chroma)
移到檢測通路中。將曝光時間優化到可以占滿 CCD 整個動態范圍后，獲取受體圖像。在不能檢測到 Cy3 熒光的條件下，關閉檢測器部件，照射受體。
重要，當進行受體的光漂白實驗時，明確光漂白以后，在供體通道內的受體的光產物沒有熒光這一點是極為重要的。
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