實驗概要
本實驗詳細介紹了GST-pull down 技術的操作流程，主要包括：GST蛋白的大量制備，谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的處理，GST蛋白的結合，細胞裂解液的預清除及細胞裂解液的探測。
實驗步驟
1. 大量制備GST蛋白
1) 活化凍存菌種GST和GST-X：按1：50比例將表達蛋白的凍存菌液加入5ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋），37℃，140~150rpm培養過夜
2) 將過夜培養物按1：100比例接入200mlＬＢ（Ａｍｐ＋），220rpm，30℃培養至OD600=0.4-0.6
3) 以預實驗確定的最佳IPTG濃度、時間和溫度誘導表達靶蛋白。（IPTG 0.5mM，20℃，150rpm培養10~16小時）
4) 誘導適當時間后，4℃，5000g離心10min后棄上清。（如需要該步沉淀能保存在-80℃）
5) 重懸沉淀：10ml菌液沉淀用1ml PBS重懸
6) 冰上超聲沉淀重懸液：2S 間隔1S 至懸液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重懸液超聲６～９min可透明）
7) 10，000g，10min離心上清轉移至新的離心管，加DTT至終濃度1mmol/L
2. 谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的處理
1) 輕輕顛倒樹脂盛裝容器，混成勻漿
2) 取適量勻漿放入離心管中，4℃，500g離心5min后棄上清（每10ml 細菌培養物可以用50ul勻漿）
3) 每1.33mL 初始勻漿加入10 mL 4℃預冷的PBS，顛倒混勻后，4℃，500g離心5min后棄上清（50ul初始勻漿用400ulPBS洗）
4) 每1.33mL 初始勻漿加入1 mL 冷的PBS，制成50%勻漿，顛倒混勻置冰上放置待用。（50ul初始勻漿加入40ulPBS）
3. 結合GST蛋白
1) 上清與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合，4℃輕搖30min（可過夜讓其充分結合）。
2) 4℃，500g離心5min后棄上清
3) 沉淀加入10倍床柱體積PBS（1床柱體積=0.5*50%勻漿體積）(50ul初始勻漿用400ulPBS洗），顛倒混勻以洗去未與樹脂結合的雜蛋白（每次可在混旋儀上混勻5min)
4) 4℃，５00g離心5min后棄上清
5) 重復步驟3和4兩次，共三次
4. 預清除細胞裂解液
1) 將細胞裂解液與50ul的和GST結合的50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂懸液在4℃翻轉混合孵育2h。（需要檢測相互作用的裂解液的量是高度可變的。開始用相當于1×106~1×107個細胞的裂解液。）
2) 離心，4℃，13，000rpm，2min
3) 將上清轉移到新的離心管中
5. 探測細胞裂解液
1) 設定兩個等量預清除的細胞裂解液分別加入到結合GST和GST-X蛋白的谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂中，4℃翻轉混合孵育2h（時間可適當延長，如過夜以讓其充分結合）
2) 離心，4℃，13，000rpm，2min
3) 用1ml冰冷的細胞裂解液洗滌，4℃，13，000rpm，2min，棄上清，重復洗三次
4) 加入50ul的2×Loading Buffer。輕彈混勻，沸水煮5~10min，離心后收集上清。