HPLC基礎知識教程（九）

  5）、池體積：除制備色譜外，大多數HPLC檢測器的池體積都小于10&micro；l。在使用細管徑柱時，池體積應減少到1~2&micro；l甚至更低，不然檢測系統帶來的峰擴張問題就會很嚴重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設計，否則會嚴重影響柱效和靈敏度。

　　3．紫外檢測器(ultravioletdetector)

　　UV檢測器是HPLC中應用最廣泛的檢測器，當檢測波長范圍包括可見光時，又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數低的物質也可用UV檢測器進行微量分析。但要注意流動相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質，則會提高背景噪音，降低靈敏度（實際是提高檢測限）。此外，梯度洗脫時，還會產生漂移。

　　注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A＝1時的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。

　　中國藥典對UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內不得超過0.40，在241~250nm范圍內不得過0.20，在251~300nm范圍內不得過0.10，在300nm以上不得過0.05。

　　V檢測器的工作原理是Lambert-Beer定律，即當一束單色光透過流動池時，若流動相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動池的光徑長度L成正比：

　　A＝lg＝lg＝ECL

　　式中I0為入射光強度，I為透射光強度，T為透光率，E為吸收系數。

　　UV檢測器分為固定波長檢測器、可變波長檢測器和光電二極管陣列檢測器(photodiodearraydetector，PDAD)。按光路系統來分，UV檢測器可分為單光路和雙光路兩種。可變波長檢測器又可分單波長（單通道）檢測器和雙波長（雙通道）檢測器。PDAD是80年代出現的一種光學多通道檢測器，它可以對每個洗脫組分進行光譜掃描，經計算機處理后，得到光譜和色譜結合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質），色譜用于定量。常用于復雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。

　　4．與檢測器有關的故障及其排除

　　1）、流動池內有氣泡

　　如果有氣泡連續不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會在基線上出現許多線狀“峰”，這是由于系統內有氣泡，需要對流動相進行充分的除氣，檢查整個色譜系統是否漏氣，再加大流量驅除系統內的氣泡。如果氣泡停留在流動池內，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；或者啟動輸液泵的同時，用手指緊壓流動池出口，使池內增壓，然后放開。可反復操作數次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動池破裂。

　　2）、流動池被污染

　　無論參比池或樣品池被污染，都可能產生噪音或基線漂移。可以使用適當溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進行清洗、更換窗口。

　　3）、光源燈出現故障

　　紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產生嚴重噪音，基線漂移，出現平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時需要更換光源燈。

　　4）、倒峰

　　倒峰的出現可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時，如果組分的折光指數低于流動相的折光指數，也會出現倒峰，這就需要選擇合適的流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質，使用紫外檢測器時，無吸收的組分就會產生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死時間附近的尖銳峰往往是由于進樣時的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起的。

　　五、數據處理和計算機控制系統

　　早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號，再手工測量計算。其后，使用積分儀計算并打印出峰高、峰面積和保留時間等參數。80年代后，計算機技術的廣泛應用使HPLC操作更加快速、簡便、準確、精密和自動化，現在已可在互聯網上遠程處理數據。計算機的用途包括三個方面：①采集、處理和分析數據；②控制儀器；③色譜系統優化和專家系統。

　　六、恒溫裝置

　　在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。

　　溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數K，但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產生氣泡。

　　色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結構的變化，對分離有影響；但如使用硬質填料則影響不大。

　　總的說來，在液固吸附色譜法和化學鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質（如緩沖劑）加入流動相中以調節其分配系數，這時溫度對保留值的影響很大。

　　不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和最小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內。

　　IV．固定相和流動相

　　在色譜分析中，如何選擇最佳的色譜條件以實現最理想分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計算機實現HPLC分析方法建立和優化的任務之一。本章著重討論填料基質、化學鍵合固定相和流動相的性質及其選擇。