HPLC故障排除：保留時間問題（二）

2.3.色譜柱溫度變化會導致保留時間的變化：每1°C的溫度變化會引起1-3％的保留時間變化。如果不使用柱溫箱（即“室溫”條件），由于實驗室溫度的變化，溫度通常會在日間（和夜間）循環（周期性）變化。

雖然在室內恒溫器的測量下，實驗室溫度顯示為恒定，但是HPLC系統的微觀（微）環境可能會發生顯著變化，尤其是當供暖或空調通風口直接吹向系統時，溫度變化極為明顯。

使用柱溫箱可以避免色譜柱出現這樣的溫度問題，且HPLC系統應遠離通風口放置。

2.4.流量（流速）問題可能是因存在氣泡、泄漏或泵問題（故障）導致的。

氣泡問題應和低壓（或脈動壓力）以及保留時間的增加相關（可能伴有柱壓過低或柱壓波動，且保留時間延長）。

對于雙頭泵，如果只有一個泵頭存在氣泡，則流量和壓力可能會發生脈動（跳動）。

應對流動相進行脫氣，然后打開放氣閥清空泵，并向泵中多次加入5-10mL的流動相，以正常流速流經泵，從而排出氣泡（打開排氣閥以正常流速的幾倍泵入5-10ml流動相經過泵，以排出氣泡）。

在某些情況下，可能需要使用低粘度的脫氣溶劑，如甲醇（MeOH）或乙腈（ACN）來清除泵中頑固的氣泡。

泄漏也會延長保留時間。配件（接頭）上的滴水配件或玻璃體內的結晶沉淀都是泄漏的證據（查看接頭如有液滴或結晶析出，可證明有泄露）。

請特別注意色譜柱上游的配件（之前的接頭）。

自動進樣器內的配件和密封件（接頭和密封圈）可能難以檢測，可借助手電筒和小鏡子進行檢查。

如果使用不銹鋼配件，通常1/4的緊固螺母（將接頭螺好再擰緊1/4圈）便可以阻止泄漏。

使用PEEK配件（接頭）時，應停止泵，松開接頭，將管子推到配件（接口）端口的底部，然后在重新啟動泵之前擰緊配件（接頭）。

擰緊PEEK配件（接頭）時如果存在流動的液體，會導致管道在配件中滑動，產生柱外死體積，進而影響分離效果。

存在缺陷的止回閥（單向閥）或磨損的泵密封件（圈）會導致流量偏低或波動。

止回閥（單向閥）出現問題將導致壓力的波動。如果在清除泵中氣泡后還無法改善壓力波動的情況，則止回閥（單向閥）可能存在故障。

可以更換新的止回閥（單向閥）；也可以將止回閥（單向閥）放置在（裝有）MeOH的燒杯中，對其進行超聲處理，以實現有效的清潔。

如果無法有效區分入口端和出口端之間的止回閥（如不易分清入口單向閥和出口單向閥），請劃線標記或用標簽標記燒杯。將每個止回閥（單向閥）放入單獨的燒杯中進行清潔，使其分開清潔。如果部件滑出，應小心組裝，以免受到污染（無塵手套，避免劃傷部件等）。

隨著使用時間的增加，泵密封件（圈）會出現磨損；而且使用緩沖流動相或將其置于高鹽條件下（例如離子交換法），會縮短它的使用壽命。

您可以建立一個預防性維護計劃，定期更換密封件并做相應記錄（準確記錄更換密封圈的時間間隔，就可以建立預防性的維護計劃），從而在故障發生前更換密封件。如果無其它指標（征兆），應至少每年更換一次密封件（圈）。

2.5.比例閥和在線混合發生故障會降低梯度洗脫的效果（使梯度洗脫效果變差）。

圖6示例顯示了兩次連續注射肽樣品的梯度洗脫分析。在這種情況下，系統適用性測試允許兩次運行之間存在0.1分鐘的變化（保留時間變化）；第一個峰值不符合該標準，最后一個峰值勉強通過而中間兩個峰值明顯超出規定值。

圖6. 兩個連續梯度運行的（兩次連續梯度洗脫）色譜圖顯示了梯度中點附近的峰形具有較大的誤差（保留時間的誤差較大）（13分鐘）。來源[3]。

下面介紹了一種檢查流動相配比（混合）精度的簡單方法。

將柱更換為0.005英寸直徑約1米長（0.12mm）的管道（取下色譜柱，換上長約1米，內徑0.005英寸（0.12mm）的管路），在A容器中加水，且B容器中放有含有0.1％丙酮的水，將檢測器波長設置為265nm，并使用足夠高的流速使止回閥（單向閥）能夠有效工作（例如2mL/min）。

以10％為增量運行一系列梯級（梯級實驗）（10％、20％、30％……90％、100％B）。

由于問題經常出現在50％B附近，所以在45％B和55％B處增添了額外的梯級。

其結果應是平滑的階梯狀（參見圖8a）。

對于圖6的樣品，在40％-60％B的梯級中觀察到圖7的曲線。

梯級是扭曲的（已變形），且45％到50％B的梯級（梯級變化）是8.4％而不是5％。

圖7中的虛線近似于（擬合了該）梯度，同時（在）45％和50％B之間存在偏移。

因此，此處應是由具有較大保留變量的峰被洗脫導致的（不幸的是，這正是那些保留時間偏差較大的峰出峰的位置）。

HPLC系統可對比例閥進行調節。

當執行此操作時，梯級會變得平滑且保留時間也會處于規格范圍之內。

圖7. 在圖6的梯度中點附近執行配比（比例）階梯測試的結果。理論值顯示在括號內。來源[3]。

如果系統性能良好，其階梯測試的結果應與圖8a類似，在整個圖中呈現階梯狀。

未注射的0-100％B梯度是應運行的對比測試（另需同時進行一無進樣的0-100%B梯度試驗）。

它應顯示為線性基線、線性梯度部分和線性后期梯度保持，每個部分之間均是平滑的曲線過渡（線性梯度部分以及一段梯度升高后維持直線，每兩段之間為平滑曲線過度）。