杜仲葉為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的干燥葉,收載于2015年版《中國藥典》(一部),具有補肝腎?強筋骨的功能,可用于肝腎不足?頭暈目眩?腰膝酸痛?筋骨瘺軟等癥的治療?杜仲是我國傳統名貴滋補藥材,傳統藥用部位為其樹皮?由于杜仲從種植到剝皮通常需要10年以上時間,周期較長,且剝皮后若養護措施不當,極易造成原植物死亡,僅以皮入藥會嚴重影響杜仲資源的可持續發展?據研究報道,杜仲葉有與杜仲皮相似的化學成分和藥理活性,有望代替杜仲皮入藥?
杜仲葉中的主要化學成分為京尼平苷酸?桃葉珊瑚苷?車葉草苷等環烯醚萜類成分,咖啡酸?綠原酸等苯丙素類成分,以及兒茶素?蘆丁?異槲皮苷和紫云英苷等黃酮類成分?據文獻報道,京尼平苷酸?桃葉珊瑚苷等環烯醚萜類成分具有肝臟保護作用,京尼平苷酸可通過調節膽汁轉運體功能起到保肝利膽的作用,桃葉珊瑚苷能夠拮抗轉化生長因子(TGF-β1)誘導人肝星狀細胞(LX-2)活化及細胞外基質成分的表達,從而起到抗肝纖維化作用；蘆丁等黃酮類成分可改善絕經后骨質疏松的骨微結構?增加骨密度,發揮抗骨質疏松的作用；綠原酸提取物則具有較強的抑菌和抗氧化作用?2015年版《中國藥典》(一部)中杜仲葉項下收載有綠原酸的含量測定項目,考慮到綠原酸并非杜仲葉專屬活性成分,同時為綜合考察杜仲葉中其他具有藥理活性的成分,本研究采用高效液相色譜(HPLC)法同時測定了不同種植品種的杜仲葉中桃葉珊瑚苷?京尼平苷酸?兒茶素?綠原酸?車葉草苷?蘆丁?異槲皮苷和紫云英苷等8種不同結構類別化學成分的含量,旨在為更全面地評價杜仲葉的質量提供參考依據?
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材料
1.1儀器
Waters 2695型高效液相色譜儀,配置2996型二極管陣列檢測器?柱溫箱?Empower Ⅱ色譜工作站(美國Waters公司)；LIBROR-160DPT型萬分之一天平(日本島津公司)；AE240型十萬分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司)；HH-S6型電熱恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)?
1.2藥品與試劑
桃葉珊瑚苷對照品(批號:111761-200601,含量:>98%)?京尼平苷酸對照品(批號:111828-201604,含量:>97.4%)?兒茶素對照品(批號:110877-201604,含量:>99.2%)?松脂醇二葡萄糖苷對照品(批號:111537-201706,含量:>91.7%)均為含量測定用對照品,購自中國食品藥品檢定研究院；綠原酸(批號:2772,純度:≥98.0%)?車葉草苷(批號:4883,純度:≥98.0%)?蘆丁(批號:5718,純度:≥98.0%)?異槲皮苷(批號:5650,純度:≥98.0%)?紫云英苷(批號:3975,純度:≥98.0%)均購自上海詩丹德生物技術有限公司；甲醇?乙睛為色譜純,其余試劑均為分析純,水為超純水?
1.3藥材
不同種植品種的杜仲葉和杜仲(皮)由靈寶德匯生態科技有限公司提供,產地均為河南省靈寶市朱陽鎮閆家馱基地(詳見表1),經河南省中醫藥研究院都恒青研究員鑒定分別為杜仲科植物杜仲(E.ulmoides Oliv.)的干燥葉和干燥樹皮,憑證標本存放于河南省中醫藥研究院中藥室?
方法與結果
2.1色譜條件
色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0~7min,5%A；7~9min,5%A→8%A；9~28min,8%A；28~30min,8%A→20%A；30~42min,20%A；42~43min,20%A→50%A；43~63min,50%A；63~64min,50%A→5%A)；流速:1.0mL/min；柱溫:35℃；檢測波長:203nm(桃葉珊瑚苷,0~9.5min；兒茶素,19.5~21min)?239nm(京尼平苷酸,9.5~19.5min；車葉草苷,25.0~32.5min)?220nm(綠原酸,21~25.0min)?227nm(松脂醇二葡萄糖苷,32.5~34.5min)?354nm(蘆丁?異槲皮苷,34.5~39.5min)?266nm(紫云英苷,39.5~60min)；進樣量:5μL?
2.2溶液的制備
2.2.1混合對照品溶液
精密稱取桃葉珊瑚苷?京尼平苷酸?兒茶素?綠原酸?車葉草苷?蘆丁?異槲皮苷和紫云英苷的對照品各適量,置于同一量瓶中,加甲醇溶解并配制成上述成分質量濃度分別為406?219?22.4?441?48.4?32.2?24.0?7.2μg/mL的混合對照品溶液,即得?
2.2.2杜仲葉供試品溶液
取杜仲葉藥材粉末(過三號篩,下同)約1g,精密稱定,置具塞三角瓶中,精密加入50%甲醇25mL,稱定質量,加熱回流30min,放冷后再次稱定質量,用50%甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過,取續濾液,即得?
2.2.3杜仲皮供試品溶液
取杜仲皮藥材約2g,剪碎,精密稱定,置具塞三角瓶中,加入三氯甲烷50mL,加熱回流1h；取藥渣,揮去三氯甲烷后連同濾紙再次置于三角瓶中,加甲醇50mL,稱定質量,加熱回流1h,放冷,用甲醇補足減失的質量；濾過,精密吸取續濾液25mL,水浴蒸干,殘渣以甲醇溶解并定容至5mL,搖勻,即得?