HPLCICPMS測定硒蛋白中硒代氨基酸的方法

　　1 引言 
　　硒是一種人體必需的微量元素，以硒酶、 硒蛋白的形式廣泛存在于生物體內，其中含有硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸殘基的蛋白質為硒蛋白[1]。硒半胱氨酸是承載硒元素最主要的方式，硒半胱氨酸也因其重要性被稱作第21個氨基酸，在哺乳動物體內參與蛋白組成，所以這種情況下硒蛋白也就是含有硒半胱氨酸的蛋白。此外，硒以硒甲硫氨酸或硒蛋氨酸為主要結合態存在于糧食中。雖然硒甲硫氨酸參入蛋白質合成可能是隨機過程，但是含有硒甲硫氨酸的蛋白也稱為硒蛋白。越來越多的證據顯示植物硒蛋白中含有硒蛋氨酸和硒代半胱氨酸[2]。最近，王衛真等[3，4]從大蒜中初步分離出硒蛋白，紙色譜證實蛋白中含有硒蛋氨酸和硒半胱氨酸。 
　　國外已有數篇文章綜述了硒形態分析的相關方法[5，6]，聯用技術被認為是進行化學形態分析（chemical speciation）的有效手段，其中高效液相色譜（HPLC）與電感耦合等離子質譜（ICP/MS）聯用作為一種高靈敏的元素形態分析方法得到廣泛的應用[7～10]。本研究建立了分離和分析硒蛋白的HPLC-ICP/MS聯用的方法，并成功地應用于不同類型實際樣品硒蛋白中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的研究。 
　　由于硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸為敏感氨基酸，其中半胱氨酸殘基的側鏈琉基不穩定；蛋氨酸的含量往往較低，且用HCL水解時特別是有碳氫化合物存在時很容易遭到破壞，所以測定不能用普通的水解方法進行[11]。本研究采用中性蛋白酶酶解，中性蛋白酶是由枯草芽孢桿菌經發酵提取而得的，屬于一種內切酶，可用于各種蛋白質水解處理。在一定溫度、PH值下，本類酶能將大分子蛋白質水解為氨基酸等產物。可廣泛應用于動植物蛋白的水解，制取生產高級調味品和食品營養強化劑的HAP和HVP。 
　　離子交換色譜包括陰離子交換色譜和陽離子交換色譜，不僅可以分離無機離子，而且可以分離任何易解離的物質[12]。陰離子和陽離子交換色譜都成功的應用于分析生物樣品中的硒形態[13，14]。Bird等比較了離子交換色譜、反相色譜、反相離子對色譜三種不同分離方法分離富硒化合物的優缺點[14]。 即使陰離子交換色譜分離能力應用不是很廣，但是它可以分離四六價硒，而這點反相色譜和反相離子對色譜是做不到的[15]。 
　　2 實驗部分 
　　2.1 材料 
　　2.1.1 儀器與耗材 
　　Varian820-MS等離子體質譜儀（美國Varian公司）；Agilent- 1200非金屬流路泵；色譜柱為Hamilton PRP-Xl00（250 mm×4 mm）分析柱和預柱（美國安捷倫科技有限公司）；水浴恒溫震蕩器SHZ88A（常州諾基儀器有限公司）；通用型高速冷凍離心機Z383K（德國Hermle）；離心超濾管3KDa（美國Amicon Ultra）。 
　　2.1.2試劑 
　　亞硒酸鈉（Se4+）、硒酸鈉（Se6+）為高純試劑（美國 Inorganic Ventures）硒蛋白硒代半胱氨酸（SeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）為高純試劑（J&K Scientific）； 胰蛋白酶；蛋白酶K（德國Calbiochem）；鏈霉蛋白酶（德國Sarva）；蛋白酶（XIV） （德國Sigma）；超純水由Thermo Fisher Barnstead 實驗室水純化系統（美國Thermo Scientific）制備。 　　3 討論： 
　　由于硒形態的不穩定性，樣品的提取過程盡量保持硒形態的原始特性不變， 比僅僅檢測硒元素復雜得多，也是植物硒形態分析準確性的關鍵[17]。在小分子硒形態方面，主要包括水提取法、酸提取法和酶提取法[18]。水提取對一些非結合蛋白形式的硒形態較適合，如硒-甲基硒代半胱氨酸、γ-谷酰基-硒甲基硒代半胱氨酸， 但對以蛋白形式結合的硒， 回收率較差；酸提取法有很高的回收率， 但酸易使硒形態發生轉變； 酶提取法的應用最廣，常用的酶有蛋白酶K，蛋白酶 XIV，胰蛋白酶，胃蛋白酶和鏈霉蛋白酶等。酶提取法通常在溫和的條件下（37℃， pH 7.0）進行，可以減少硒形態之間相互轉化，但此法提取的時間較長， 一般需 24～48 h。為保證解離完全，酶活性對樣品的適用性與通用性，最后選定運用蛋白酶K、鏈蛋白酶、胰蛋白酶來進行酶解（見圖1）。 
　　由于SeCys2、SeCys、SeMet 等硒的化合物隨著p H 值的改變化合物形態可呈現中性、帶正電或帶負電，可見離子交換色譜分離模式比較適合硒蛋白形態的分離，離子交換色譜是形態分析，蛋白質組學中使用最為廣泛的色譜技術之一[19，20]，具有柱容量高，分辨率高，條件溫和，分離后樣品可被濃縮等優點；反相離子對色譜操作簡便、柱效高，廣泛用于極性的元素形態分離中。對硒代氨基酸有良好的分離效果，在本研究中較易控制且有明顯效果的是流動相的性質。因此考慮到流動相對樣品的緩沖能力所以本研究決定使用5mM的檸檬酸銨加2%的甲醇（pH4.9）作為流動相。 
　　較氫化物一原子吸收光譜法、熒光分光光度法、原子吸收光譜法等方法這種檢測方法能夠更精準的對硒蛋白中硒代氨基酸進行檢測，根據酶解產物在HPLC-ICP-MS色譜圖中各峰的保留時間來實現硒蛋白的定量檢測，該方法的建立無疑是對食品成分分析和食品的開發利用具有重要意義。