一、戊二醛二步法
1. 原理
戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。
2. 標記步驟
（1）稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
（2）反應后的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
（3）將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
（4）用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3小時。
（5）加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。
（6）在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃ 1小時。
（7）3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
（8）將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。
3. 結果判定
（1）定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定( 見本節 (三)工作濃度的選擇)。
（2）定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程1cm)。
酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4
IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
（3）本法標記步驟比較簡單，重復性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2-4%的酶與蛋白質結合。
4. 試劑及器材
（1）0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。
（2）1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml與PH6.8的PBS 1ml混合。
（3）1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。
（4）0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。
（5）0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。