IDMS法測定血清中的生長激素

圖1.  生長激素的IDMS測定法示意圖：將“指紋碎片”T6以胰蛋白酶進行蛋白質水解，并對分析溶質予以富集后，借助于RP-LC-MS/MS進行定量測定。

在醫學上，為了進行早期診斷以及對疾病進行醫療控制，經常需要對血清中的所謂標記蛋白質進行量化。這些蛋白質分子尺寸微小，結構復雜，血清蛋白濃度需在超過10個數量級的動態范圍中進行定量測定，為準確的分析方法建立提出了挑戰。

人類的生長激素由腦垂體產生，這是一種由多種蛋白變異體（亞型）構成的異質性產物。除了22 kDa（千道爾頓）分子量的主要組分外，還具有20 kDa分子量的亞型以及更小的變異體。由于生長激素的供應不足會導致兒童侏儒癥，而供應過度又會造成成年人肢端肥大癥或兒童巨人癥，生長激素的測定被用于對疾病進行診斷。在生長激素定量測定的例行分析方法中，免疫測試法并未將亞型加以區分，這樣做雖然靈敏度較高，然而可能存在因試劑盒不同而導致結果偏差較大的缺點。產生這種偏差的原因在于，采用的垂體萃取物是含有亞型混合物，因試劑盒的具體情況而異；另外，試劑盒所用的具有選擇性的抗體所引起的交互反應也是一個原因。

圖2.  將分析溶質從樣品基體中進行分離富集，然后用LC-MS/MS進行定量測定的示意圖。

同位素稀釋質譜法IDMS

同位素稀釋質譜法（IDMS）相比免疫法而言受到基體的影響較少。對于血清中低分子量的診斷標記物的定量測定，如甾體激素，已建立了成熟的方法。鑒于最常用的血清白蛋白和靶蛋白質如人類生長激素之間的濃度差別高達7個數量級，因此采用IDMS法必須預先進行基體分離并富集分析溶質，減少抑制離子化而引起的信號降低以及所伴隨的靈敏度損失。為了用IDMS法進行標記蛋白質定量，擬采用蛋白質組學的樣品前處理方法，針對靶蛋白質有代表性的“指紋碎片”，蛋白質水解后借助于胰蛋白酶或者其它的蛋白酶進行測定（見圖1）。圖1是對摻入垂體萃取物的血清樣品進行定量的離子譜圖（測得濃度為12 μg/L），為T6以及T6*專用的MS-MS過渡所攝制。碎片T6和內標T6*分別以藍色（T6）和紅色（T6*）顯示，在生長激素序列中，胰蛋白酶的碎片化通過剪刀進行標記，而氨基酸的序列按照字母順序表示。

圖3.  人類22 kDa生長激素的氨基酸序列圖。胰蛋白酶分裂為賴氨酸（K）和精氨酸（R），這些氨基酸以深灰色表示，用于定量測定的碎片位于灰色之中。

富集方法

靶蛋白質可以直接在血清中進行富集，此時必須采用以同位素標記過的完整蛋白質作為內標，旨在對富集過程中靶蛋白質的損失進行補償。靶蛋白質可通過免疫沉淀法借助于固定的抗體進行富集（見圖2A）。為了進行定量測定，可采用多克隆的抗體，這樣對靶蛋白質亞型一并富集的概率更大。將所富集的萃取物進行蛋白質水解反應，選擇碎片作為完整蛋白質的代表，以IDMS法進行測定。這種富集方法的缺點在于以同位素標記的完整蛋白質只有較小的可用性。

另一種方法是首先將全部血清進行蛋白水解，將所選取的靶分子碎片與干擾性的基體部分進行分離，最后以IDMS法進行測定。當碎片被完全水解，定量地從靶蛋白中釋放出來的前提條件得到滿足時，可將同位素標記的碎片作為內標，通過此富集方法進行應用。這種方法容易通過化學合成實現，同時也較為廉價。分析溶質從蛋白質中釋放地越緩慢，則相對內標出現的結構差別就越大，通過同位素標記的碎片進行補償就更難完全。需注意的是，所選用的碎片必須是化學上穩定的，而環境條件應使水解反應快速進行，以便獲得蛋白定量的高度準確性。當采用以同位素標記的完整蛋白質為內標時，就避免了由于不完全水解所產生的問題，碎片的釋放仿照靶蛋白進行。

圖4.  兩種控制材料HP1/08A和B中生長激素的測定：藍色屬于西門子醫藥系統，綠色屬于意大利Diasorin公司，灰色為其它制造商提供，紅色圓圈為基于T6的IDMS測定結果，紅色三角為基于T12的IDMS測定結果。

碎片及其同位素標記的對應物的富集可以如同處理完整蛋白質一樣，通過免疫沉淀法固定于一種對碎片具專屬性的抗體上（見圖2B）。如果采用單一型抗體代替多重型克隆型抗體，則富集的選擇性會有所提高。一種變通的富集方法是采用半制備式液相色譜法（見圖2C），分步地采用半制備反相液相色譜以及強酸性陽離子（SCX）交換色譜。以結扣所示的靶蛋白質以及它的以圓圈表示的碎片均通過顏色加以凸顯（見圖2C）：天然的為藍色，同位素標記的為紅色，其它的血清和蛋白水解物的基體成分則以灰色表示。相對于免疫富集法必須針對每種所選的碎片配置以專門的抗體而言，這種液相色譜法的優點在于具有較高的靈活性，選擇能夠代表靶蛋白質的碎片進行IDMS法測定。

實驗過程

人們按照需定量測定的靶蛋白質所相應的亞型來選擇穩定性良好的碎片，碎片的質譜檢測法需要具有足夠的靈敏度，借助于數據庫選擇碎片時，可避免與其它血清蛋白質序列的重疊。

人類生長激素的質譜測定法，是對總血清加入胰蛋白酶來進行前述的蛋白質水解，繼以液相色譜法對兩種碎片T6和T12（見圖3B）及其同位素標記的對應物進行分離，所測結果的濃度范圍為3~30μg/L。

將兩種碎片T6和T12通過二維半制備液相色譜進行提純。第一步是于反相柱（RP柱）上進行預分離。截取富集的T6 和 T12餾分，然后以強酸性陽離子（SCX）交換色譜法進行進一步提純。在采用C18小管以固相萃取法除掉鹽分后，就可將所富集的碎片通過由反相色譜法聯合串聯質譜檢測器進行定量測定（LC-MS/MS）。根據蛋白質水解反應后從生長激素中釋放出來的碎片信號,與水解前加入到血清中的同位素標記的標準所產生的碎片信號之間的比例關系，就能夠測出樣品中生長激素的含量。為了加入確定的生長激素和標準，采用了高純的儲備溶液，儲備溶液的濃度通過將參照物質分裂為氨基酸后以IDMS法進行氨基酸分析。

為了驗證IDMS法對生長激素的測定，將準確含量的重組22 kDa生長激素和同位素標記的標準物加入到一種血清樣品中，該樣品是不能采用前述方法進行驗證的。將這種含添加物的血清樣品中所測得的濃度與通過加入生長激素而調制成的數值進行比較，就能夠驗證定量方法的準確性。數次測量值的中位值相對于期望值的偏差，對于兩種碎片T6和T12而言，均小于結果的相對標準偏差。所測得的濃度表明與期望值之間沒有顯著的偏差。

與免疫分析法的比較

傳統的商用檢測手段所進行的質量控制結果，其分散性超過了臨床上重要的生長激素的濃度范圍。而采用IDMS法對生長激素進行的測定，雖然對于例行診斷而言時間會相對緊張，但卻能夠為控制材料提供準確的參考數值。對這兩類參考材料中的生長激素進行了補充性量化測定，對照174個檢測實驗室的結果，所測結果見圖4。

檢測限的降低

在實驗室醫學診斷中，對肢端肥大癥進行抑制試驗。血清中生長激素的濃度應該由抑制制葡萄糖的劑量而降低到1 μg/L以下，以排除肢端肥大癥。為了在將來也能夠采用IDMS法來定量測定抑制試驗中生長激素的濃度，必須提高測定方法的靈敏度，目前按照線性相關法從校正曲線計算出的檢測限對于T6 和 T12分別為1.7和2.7 μg/L。這種IDMS法還不夠靈敏，不足以將激素的生理體液抑制到低于1μg/L時進行顯示。當前正在研究是否能夠通過改善分析富集的方式來降低檢測限。

作者簡介

Christian Arsene博士:1991~1997就讀于漢堡大學化學專業，1998~2002于布倫瑞克大學取得博士學位，博士論文“鱗翅類中長鏈脂肪的結構解析與反應研究”，2003~2005任職于瑞士Buchs西格瑪奧德里奇公司化學發展部，2005起任職于布倫瑞克聯邦物理技術局（PTB）生物有機分析組。