實驗方法原理
IL-1與小鼠胸腺細胞共同培養時,IL-1可刺激小鼠胸腺細胞增殖。進一步通過3H-TdR摻入法或染料攝入法判定小鼠胸腺細胞增殖量,推定IL-1的生物學活性。通過檢測IL-1的生物學活性,可了解單核-巨噬細胞等的功能。
實驗材料 小鼠胸腺細胞
試劑、試劑盒 FCS-RPMI-1640培養液LPS刀豆蛋白A3H-TdR
實驗步驟
1. 小鼠巨噬細胞產生IL-1的誘導
(1)常規收集小鼠腹腔巨噬細胞,10%FCS-IMDM培養液懸浮細胞2×106/ml,接種于24孔培養板,0.5 ml/well。
(2)每孔加20 ug/ml LPS 0.15 ml,37度,5%CO2孵育36~48小時。
(3)此時培養上清內含巨噬細胞分泌的高水平IL-1,收集培養上清,12000 r/min 離心15分鐘,將上清移入新的1.5 ml 試管中,-20℃凍存。
2. IL-1的生物學活性測定
(1)胸腺細胞的制備:頸椎脫位處死小鼠,無菌取胸腺至于平皿中,加入5 ml 10%FCS-IMDM培養液,200目不銹鋼網制成單個細胞懸液;1500 r/min 離心10分鐘,再用5%Hank’s液洗滌細胞2次后,重懸于10%FCS-IMDM培養液中,調細胞濃度為1.0×107/ml。
(2)加樣:取胸腺細胞加入96孔細胞培養板,0.1 ml/well。再加入IL-1待測樣品或IL-1標準品,50 ul/well,實驗孔再加入50 ul ConA(終濃度0.625 ug/ml),同時設培養液對照孔(0.1 m l細胞+0.1 ml 培養液)、ConA對照(0.1 ml 細胞+50 ul 培養液+50 ul ConA),均設3復孔。37度,5%CO2孵育36~60小時。
(3)3H摻入:每孔加1.85×1010 uBq/20 ul(0.5 uCi/20 ul)3H-TdR,繼續培養8小時。
(4)測定:多孔細胞收集器收集細胞于玻璃纖維濾紙上,用β液體閃爍儀測定3H-TdR
(5)摻入量(cpm)以凈cpm值(實驗孔-ConA對照孔cpm值)為縱坐標,對應的不同稀釋濃度IL-1標準品為橫坐標,在半對數圖紙上繪制出標準曲線,再從標準曲線上查出待測樣品中的IL-1含量。
注意事項
1. 吸取LPS刺激的小鼠巨噬細胞培養上清時,必須離心,以除去細胞及細胞破碎成分。
2. ConA應選擇淋巴細胞轉化實驗的亞劑量,即選擇能夠激活胸腺細胞,又不引起明顯增殖的量,如果ConA過量,則不能有效反應IL-1的刺激活性。