實驗概要
INS-1細胞培養
實驗步驟
所需要的各種溶液
1.培養基（4℃保存，使用前在37℃水浴中溫育）
1) RPMI 1640 with Glucose(11mM)
90ml
2) Fetal Bovine Serum (滅活)
10ml
3) Sodium Pyruvate(100mM,使細胞增加內源性CO2的產生)
＋1ml
4) β-Mercaptoethanol(自由基的清除劑)
0.1ml
=101.1ml
2.Poly-L-Lydine:0.1mg/ml（4℃保存，）
3.Trypsin-EDTA（胰酶）（－20℃保存，使用前在室溫自然溶解）
Contains 0.5 g/L of trypsin (1:250) and 0.2 g/L of EDTA?4Na in Hanks' Balanced Salt Solution without CaCl2, MgCl2 ? 6H2O, and MgSO4 ? 7H2O. Contains phenol red.
4.磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（4℃保存，使用前在37℃水浴中溫育）
137mmol/L NaCl (8g)
2.7mmol/L KCl (0.2g)
10mmol/L Na2HPO4 (1.44g)
2mmol/L KH2PO4 (0.24g)
在1L三蒸水中加入四種成分，調pH 7.4, 滲透壓 300mOsm.
FBS滅活：
無菌的PBS分裝前，56°溫浴 30min，滅活。然后分裝。
細胞滴片傳代
1. 準備超凈工作臺，將試劑及材料置于超凈臺上，開始實驗。
2. 仔細檢查培養物有無污染或衰退跡象。
3. 依照傳代標準（70％－90%的密度）決定是否對細胞進行傳代。
4. 在酒精燈下烘干小玻片（每個小培養皿1個玻片），涂上.Poly-L-Lydine,5分鐘后吸干，用無菌水洗一遍，在超凈臺內自然晾干。
5. 將培養細胞置于無菌工作區域，棄去舊培養基。
6. 為了避免沖散細胞，沿培養瓶細胞面對側加入PBS(對應相應培養基的體積)，清洗細胞，去除清洗的PBS。這一步的主要目的使去除殘留血清，因為血清可抑制胰酶的作用。洗兩遍。
7. 加入胰酶于12孔板中（0.1ml/孔），緩慢搖晃確保胰酶完全覆蓋細胞層。室溫或37度下消化細胞。
加入胰酶于培養瓶中（1ml/孔），緩慢搖晃確保胰酶完全覆蓋細胞層。37℃下靜置于培養箱中1.5min-2min。可以拍打細胞生長面觀察胰酶的消化效果，只要有細胞脫落即可終止消化。
8．加入培養基終止消化，用槍頭或移液管反復吹打單層培養細胞面以分散細胞成單細胞，注意盡量不要產生氣泡。（INS-1細胞比較脆弱，對于6孔板的細胞緩慢吹打10－20次，對于培養瓶緩慢吹打20－30次即可，主要根據單細胞的百分比確定吹打的終止，一般對于70％－90％的單細胞百分比即可終止吹打）
9．根據細胞的密度估計相應的體積的細胞到小玻片上，在37℃培養箱中靜置10-20min，加入2ml培養液。20－72 h之后即可進行實驗
Poly-L-Lydine:先配成1mg/ml的母液，用時1：7或1：9稀釋即可。（0.1mg/ml）
G418:100mg/ml, 100ml INS1培養基中加入400ulG418抗生素。
Cell Cultures
INS-1 cells (27) (a gift from C. Wollheim, Geneva, Switzerland) were routinely grown at 5% CO2-95% air at 37 C in RPMI-1640 containing 11.1 mM glucose and supplemented with 10% FBS, 1 mM pyruvate, 10 mM HEPES, 50 M 2-mercaptoethanol, 100 U penicillin/ml, and 100 g streptomycin/ml. In all the experiments described the RPMI-1640medium contained the supplements described above. Cells were passaged weekly after trypsin-EDTA detachment. All studies were performed on INS-1 passages between 70 and 84.