IgM的純化

大多數IgM類抗體是優球蛋白不溶于水，故可用雙蒸水透析純化IgM。對那些溶于水的IgM類抗體可用飽和硫酸銨沉淀。沉淀后可以采用顆粒排斥層析法(凝膠過濾)進一步純化。

顆粒排斥層析(size-exclusion chromatography)法又稱分子篩層析或凝膠過濾，是利用微孔凝膠分離不同大小分子的抗體，可用于樣品中IgG和IgM的分離，常用于對硫酸銨粗提物的進一步純化。通過該法純化所得抗體可用于Ig分子片段的制備、FITC、生物素或同位素標記。

一、材料和試劑

1. 抗血清，雜交瘤腹水或其上清，硫酸銨沉淀粗提γ球蛋白。

2. 含0.02%NaN3 的硼酸緩沖液，PBS。

3. 透析袋；26mm×900mm層析柱。

4. 適當篩孔的顆粒排斥(SE)凝膠(AcA Ultragel-或Sephacryl S-200(Pharmacia LKB)。

5. 蛋白透析、SE層析和SDS-PAGE所需的其他試劑和器材。

二、操作步驟

1. 待提取樣品11，000～13，000r/min(15，000～20，000×g)，4℃或室溫離心，除沉淀。

2. 上清液對雙蒸水透析4℃24h。

3. 11，000～15，000r/min 4℃ 或室溫離心1h，留沉淀。

4. 制備SE凝膠層析柱，以硼酸緩沖液平衡。

5. 將步驟3沉淀或飽和硫酸銨粗提γ球蛋白以3～5ml硼酸緩沖液溶解，緩慢加樣。

6. 以硼酸緩沖液洗脫蛋白質，并收集100管(每管為柱床體積的1%)，IgM在洗脫液的第一個蛋白峰。

7. 收集Ig蛋白峰，分別合并，透析濃縮，紫外分光光度計OD 280nm測定Ig含量，SDS-PAGE鑒定IgM純度。

8. 以1～20mg Ig/ml硼酸緩沖液置4℃或-70℃保存。