Isotype胞內染色有哪些學問？來看看這篇文章怎么說

　　對科研黨來說，流式細胞術一點都不陌生，它以自己特有的方式從細胞蛋白水平定量檢測目標蛋白的表達，并且能get到目標蛋白在各個細胞亞群中的表達，同時在細胞功能上也有很重要的作用，包括細胞凋亡，細胞周期，細胞增殖等等。

　　流式細胞術以細胞為研究對象，在流式細胞儀的作用下定量檢測樣品細胞的物理化學特征，其定量是以光信號為基礎的，通過分析接收到的激光照射到細胞后的散射光信號和熒光信號完成定量分析。散射光信號是激光照射到細胞后散射形成的，散射光的波長與激光的波長相同；熒光信號是細胞上結合的熒光素被激光激發后產生的，一般熒光信號的波長要長于激發它的激光的波長，流式細胞儀通過光路系統將熒光信號根據波長的不同分成不同的部分，不同波長的熒光分別進入各自的接收器被流式細胞儀接收和分析。

　　在大部分流式表面染色的實驗中，不需要特定緩沖液來支持，同時在表面染色中的陰性對照通常是不染色的 blank 和同型對照 isotype。所以針對表面 marker 的流式實驗設計會顯得比較容易。在此基礎上，如果您的實驗中需要用流式細胞術來探索胞內的指標，您還需要考慮其他的一些因素。

　　1選擇合適的濃度

　　在細胞表面染色的實驗中，抗體的合適濃度是十分重要。一樣地，在胞內染色實驗中依然是十分關鍵。抗體的推薦溶度可以在我們官網的 Technical Data Sheet 上的推薦濃度部分中找到，如下圖所示：

　　BioLegend 提供的推薦濃度都是經過 3-5 點的滴定，從中選擇了一個最好的信噪比的濃度作為推薦濃度。

　　雖然推薦濃度是經過我們廠內驗證，但是由于您的實驗環境，條件和樣品的不同，您還需要進行抗體滴定來確認最適合您的實驗體系的抗體濃度。如果在實驗中使用的抗體不足，您可能檢測不到目的群體，或者目的群體的分群不夠理想。然而，倘若您在實驗中使用了過量的抗體，很可能會出現所有細胞群體的背景信號增加，這樣在數據分析的時候就會出現偏差，這種現象常稱之為“胞內漂移”（intracellular shift）。

　　2選擇合適的緩沖液

　　如果需要檢測胞內指標，就需要先對細胞進行固定（fixation），然后將細胞進行透化（permeabilization）。最常見的固定劑是多聚甲醛溶液（paraformaldehyde， PFA），它能穩定細胞膜結果，之后通過去垢劑或者酒精再對細胞進行透化處理。細胞經過透化處理之后，抗體就可以直接進去入細胞內部去結合胞內的目標蛋白。目的蛋白在細胞內的定位，會決定最適合于實驗的緩沖液。

　　胞漿內蛋白

　　對于胞漿內蛋白的染色，比如細胞因子，通常需要進行兩步法的固定和透化處理，BioLegend 提供了兩種適用的 buffer 套裝可供選擇：

　　a）Fixation Buffer 和 Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X)。

　　b）新發布的 Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set。

　　如上所見，第一個選項中 fixation buffer 和 intracellular staining Permeabilization wash buffer 是獨立包裝的兩個產品，而新發布的 Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set 是包含了 fix/perm buffer 和 perm wash buffer 的套裝，并且套裝是一并經過 QC 質控，相比于傳統的 fixation buffer 和 Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X)，Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set 在信噪比上的表現更好。這樣的話，可以提供更穩定及可重復的結果。

　　下圖為分別使用了 fixation buffer/intracellular staining Permeabilization wash buffer 和 Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set 在極化的人 Th1 細胞的胞內染色結果：

　　核內蛋白

　　如果您的研究是研究核內的指標，比如轉錄因子，不僅僅需要緩沖液透化外部的細胞膜，還需要透化細胞核核膜，使得抗體可以進入細胞核內，結合核內蛋白。為了做好核內蛋白的染色，我們推薦使用 True-Nuclear? Transcription Buffer Set 來作為實驗緩沖液。這是我們 FOXP3 Fix/Perm Buffer Set 的升級版。某些核膜透化的buffer會影響串聯染料的表現，增加溢漏到串聯染料的 donor 通道的熒光補償。

　　人全血使用APC/Cy7 CD3抗體（藍色和紅色柱狀圖）或APC/Fire? 750（綠色和紫色的柱狀圖）染色，然后進行紅細胞裂解，清洗之后再按以下條件進行固定：A、使用FOXP3 Fix/Perm Buffer固定后用FOXP3 Perm Buffer進行透化（紫色和紅色）；B、使用True-Nuclear? Fix Buffer固定，再用True-Nuclear? Perm Buffer透化（綠色和藍色）。

　　從上圖中可以看到，使用 FOXP3 buffer 套裝時，APC/Fire? 及 APC/Cy7 溢漏到 APC 通道的補償值明顯大于 True-Nuclear? Transcription Buffer Set.

　　磷酸化蛋白

　　當我們使用磷酸化特異性的抗體分析細胞內的蛋白磷酸化水平時，就需要能夠比胞漿內染色及核內染色更強力的固定破膜劑。在做磷酸化蛋白的染色時，推薦使用基于甲醇的，專門為磷酸化蛋白染色優化的 True-Phos? Perm Buffer。

　　上圖中是人全血使用（右圖）或不使用（左圖）IL-6刺激15分鐘之后，使用RBC/Lysis Fixation Solution 進行裂紅處理，然后使用True-Phos? Perm Buffer進行透化，之后使用CD3 APC和 STAT3 pY705（clone 13A3-1）FITC進行染色。

　　由于 True-Phos? Perm Buffer 含有甲醇，在使用時需要注意用于表面染色的抗體是否適用于含有甲醇的緩沖液。甲醇有時會改變甚至破壞抗體識別的表位。所以，在正式實驗之前，需要通過預實驗或者文獻來確定表面染色所用的抗體是否適用于甲醇固定的樣品，BioLegend 的網頁 fixation page 中，提供了我們廠內測試的一些克隆號在 4% PFA 固定之后的表現，雖然它們不是甲醇固定，但是依然是您參考的一個方向。如果您選用的抗體克隆不適用于甲醇，那可以嘗試在固定之前對表面指標進行標記，不過需要注意的是選用甲醇不敏感的熒光素，如下表所示：

　　“特殊照顧對象”

　　凡事皆有例外，盡管我們提供了多種 buffer 來匹配相應的實驗，但是不得不承認，依然有某些克隆的抗體，我們還未優化好相應的 buffer，比如 Ki-67 的 16A8 克隆號的抗體。不過，16A8 可以使用 70% 冰乙醇作為固定破膜劑，詳細的使用請見相應的產品說明書。

　　3選擇合適的對照

　　何為陰性何為陽性？選擇合適的對照就顯得格外重要。我們的官網中介紹了流式實驗中的常見對照組：https://www.biolegend.com/flow_controls

　　同型對照-isotype control

　　假如您的實驗只涉及了細胞表面的染色，同型對照就是一個理想的對照組。但是在胞內染色時，只有同型對照，還不足以準確地進行數據分析。在做胞內染色的流式實驗時，我們時常發現整個細胞群體都發生了漂移，這樣就會在數據分析的時候誤導我們，難以判斷什么才是真正的陽性細胞群體。所以在胞內染色實驗時，isotype 只能作為一個參考，但是不能作為最終劃門的標準，尤其在那類陰陽性細胞有明顯的界限的情況下。如下圖所示，假如您是按照 isotype 的 MFI 值來劃定十字門（黑色實線），您會在 Q1 和 Q2 門里發現，陽性細胞的比例變高了。如果按照陰性和陽性的分界線來劃門（紅色實線），您獲得的數據就會更加準確。

　　生物學對照

　　當做胞內細胞因子或者信號通路分子的胞內染色時，選用生物學對照作為劃門的標準是個不錯的選擇。比如說，您的樣品細胞是 PMA/Inomycin、LPS 或者 CD3/CD28 刺激的細胞，您也應該同時準備相同類型的細胞，但是不給予相應的刺激。這樣才能區分出刺激前后，目的蛋白的本底表達水平和接受刺激之后細胞應答所產生的表達變化。

　　人外周血極化得到的Th2細胞僅使用monensin處理（上左圖）或使用monensin及PMA、Ionomycin處理三小時后（上右圖）使用CD3（x軸）表面染色和GM-CSF（Y軸）胞內染色結果。

　　熒光減一對照（FMO）

　　除了以上的對照組外，還有一個重要的對照，即熒光減一對照。顧名思義，FMO 指的是使用的熒光為您樣品所有染色指標減少一個指標的對照。這一對照不僅可以幫助您界定弱表達指標的陰陽性，還可以在多指標的 panel 中幫您從熒光溢漏的信號中區分出陰性群和陽性群。

　　希望通過本文，可以幫助您理解胞內染色實驗中的一些注意事項，比如確定合適的抗體濃度、buffer 以及合適的對照。最后，愿各位研究者能夠獲取一致并且可信的數據。