LCMS生物分析方法轉移失敗原因分析

一個成功的方法轉移不僅取決于發送和接收雙方實驗室在規范生物分析方面的經驗與知識，而且還取決于對被轉移方法特性的理解和溝通。兩個實驗室在HPLC系統、質譜、移液方法、自動移液系統、試劑、試劑儲存、洗板器、玻璃管硅化方法、特殊設備的使用、漩渦混合器，甚至通風櫥的氣流量等方面的微小不同，都可能導至方法轉移驗證的失敗。因此，對于發送和接收雙方實驗室而言，在方法轉移之前應就方法的細節進行清楚溝通，這至關重要。

原因二 物質的穩定性原因

被分析物或其代謝產物的穩定性也能影響樣品分析的重復性和準確性。造成待測化合物或其代謝產物不穩定的因素有許多，包括酶催化降解（如含酯藥物或者藥物前體）、化學反應（如硫醇化合物）、兒茶酚類的自動氧化、內脂和羥基羧酸的互相轉化（如他汀類化合物）、氮氧化物的降解及Ⅱ相代謝產物降解、手性/差向異構/互變異構/同分異構互相轉化等。在以上原因中，以Ⅱ相結合物（如酰基葡萄糖醛酸）的代謝產物在樣品儲存、處理或色譜分析過程中降解為母體被測物的過程最為常見。不穩定的Ⅱ相結合物的降解無疑會導至對母體化合物濃度的高估及已分析樣品在接收方實驗室重新分析時明顯的正向偏差。復審被測物和代謝產物的穩定性并測試相關穩定性是至關重要的。如果被測物確實包含不穩定的代謝產物，應當對液相色譜-質譜（LC-MS）分析之前的樣品收集和處理有些額外的穩定措施。任何發現都應當向接收方實驗室交代清楚。

原因三 不合適的方法選擇性

分析方法選擇性的評估應當用6組不同基質配制的LLOQ濃度樣品。在這6個LLOQ濃度樣品中，5個分析結果的偏差值應在標示濃度的±20%內。對于一些難以獲得的基質，可以用少于6組的基質來進行選擇性測試；在轉移之前，甚至可用一組合并的基質來進行測試。測試單組基質會掩蓋不同組基質間的區別，這會在樣品分析選擇性不佳的情況下導至方法轉移的失敗。除一些常見的內源性組分（如磷脂）外，已知或者未知的代謝產物，給量媒介，以及同時服用的藥物，都會導至分析選擇性的不足。

對分析物進行色譜分離的主要依據是分析物和基質組分相對于移動相和HPLC柱上固定相的物理化學性質的不同。當質譜在單反應監測或者多反應監測（MRM） 模式下工作時，干擾會比較少。大氣壓離子化技術[如電噴霧離子化（ESI）和大氣壓化學離子化（APCI）] 被普遍認為是“軟性”的分析技術。然而，任何有弱鍵的分子都能夠在進入串聯質譜Q1室之前的電離過程中裂解（源內裂解）。如果生物樣品提取物中存在分析物的氮氧化、硫氧化、葡萄糖醛酸或者硫酸共軛等代謝產物時，這一“源內裂解”尤其明顯。這些代謝產物的源內裂解可產生和母體化合物前體離子相同的離子。在高通量液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析中，色譜分離效果往往因為大大縮短的液相色譜分離時間而受到影響。如果發送方和接收方實驗室的色譜條件有所不同，代謝產物的源內裂解可能造成發送和接受方實驗室測得的已測樣品濃度明顯不同。在這種情況下，常常需要在一方或雙方實驗室對色譜方法進行修改以便重新進行方法驗證。

原因四 常見實驗操作差錯

對已測樣品再分析（IS R） 的失敗可能并不是由分析方法本身的問題（選擇性或者穩定性問題）引起的，而是由實驗操作的差錯引起的。這些差錯包括但不局限于：①樣品沒有充分融化，②在取樣之前樣品不均勻，③樣品稀釋不當，④樣品標識不清。鑒于此，應該確保對實驗室人員的正確訓練。