LCMS／MS定量分析的經驗與體會

1. 準備工作

● 查閱文獻

● 做好樣品前處理，萃取濃縮分離純化

● 有條件的可先在HPLC上摸好LC條件，能夠基本分離更好，緩沖體系符合MS要求

● 溶劑包括水的純度，最好色譜純以上

● 新的色譜柱可能要先沖洗很長時間才能干凈,某些樣品非常容易吸附在進樣閥和管路中，用溶劑清洗

● 質譜儀須校準，預熱時間要足夠長，氣流的穩定也很重要，液N氣閥開度要注意，達到穩定程度

2. MS條件優化——先定性后定量

● 首先，確定離子化方式：

ESI or APCI，POS or NEG

● 用10-100ppm的純樣，Q1 SCAN 察看存在哪些離子，要能夠看到待測的母離子，應明顯比周圍的噪聲離子高，通過改變DP,觀察離子的增減,若為POS方式，看M+1，M+18，M+23等等,初步判斷分子離子,如看不到則可能是濃度太低或離子化方式不合適，或選擇的溶劑體系不合適

● 母離子選M+H,或M-H最好,但有時只有M+NH4,M+Na等,這樣CAD能量可能需要高些,選擇[M+H]+，還是+NH4，+Na等，要由化合物決定。加合離子若穩定，則可用，不穩定則可能需換流動相，但+H通常好些，所需碰撞能量低，靈敏度高；如含Cl可選擇2個母離子峰

● SIM與MRM，單級Q只能SIM，MRM可看成2個SIM，選擇性更好

● 再根據上一步確定的母離子進行PRODUCT SCAN，確保所有碎片離子都來自待測化合物，而不是溶液中的雜質，找出較強的碎片離子信息。還可改變CE，從中選定MRM需要測定的一對或更多離子對,為最后LC-MS/MS聯用做準備

● 做PRODUCT SCAN時，注意小數點后的位數,MRM輸入要準,靈敏度才高

● 先多選幾個離子對，待出現基質干擾時可換，最后根據法規要求確定離子對數目

● MRM方式優化儀器，通過優化儀器參數，使得母、子離子都達到一定強度水平，使MRM靈敏度最高。可先讓儀器自動優化參數，然后再手動細致優化，只檢測一對離子時根據TIC的強度來確定儀器參數，一次優化多對離子時，要根據每對離子的XIC強度來分別確定儀器參數

● 先用注射泵優化COMPOUND項下面的參數，如DP、CE及CAD等，再接通LC，用FIA優化其他參數如溫度，氣流和IS電壓及離子源位置，或接一個三通，樣品仍由注射泵進入離子源，同時LC保持需要的流量. 然后進行MRM測定。

● CURTAIN GAS在不降低靈敏度情況下盡量大些，霧化輔助加熱氣流不用太大，這樣可以提高信噪比，保持信號穩定。

● 分辨率的選擇：當樣品較純，Q3可選LOW，提高靈敏度，若選LOW后本底噪聲太高則意義不大。

3. LC條件優化

● 色譜柱長度可根據分離的要求而定，定性可長些,定量在能有效排除干擾情況下盡量短,提高效率；內徑最好選細徑柱如2mm的,1mm的,IS可不分流, 4.6mm柱用1ml流量時如不分流靈敏度還不是最佳,不如流量低時更好。流速高，峰形好

● 不同牌號色譜柱，效果很可能不同

● PH的影響-正離子方式PH要低些，負離子方式PH要高些，除對離子化有影響外，還影響LC的峰形，以至定量誤差。流動相加乙酸銨可適合大部分測定要求

● 用流動相配的標樣，初步優化確定LC條件是否合適

● 標準品工作液現配現做，尤其是較低濃度，時間長了可能因吸附分解等降低

● 進樣順序要先稀后濃

● 洗針液要常換，進過濃樣后要進一針空白，檢驗是否有殘留污染

● 順序：純樣-添加樣-實際樣品

● 流動相液優化后，空白提取液配制標準再優化，看干擾，空白添加再提取后看回收率

● 用空白提取液配制標準樣做曲線，準確，有效排除干擾因素

前處理方法的優化

● LC，MS都優化還不行，改提取方法

● 離子抑制-改變前處理方法或LC條件

● 內標用法，藥代動力學時多采用內標，選擇原則：內標物與被測物的化學性質有區別時，要注意干擾基質對他們的離子化影響的不同，盡量選同系物。還可利用同位素標記

● 衍生化：有時有助于信號強，且穩定，例如硝基呋喃類，衍生化

后容易測量。

4. 數據處理

● 最低檢出限，信噪比～3:1，定量限～10:1

● 同一物質幾對離子的比例應相對恒定，誤差不超過15%，峰面積比峰高準確

● 當濃度低，信號弱，自動積分不準時可對峰面積手動積分

● 平滑次數與峰寬因子、保留時間等設置都會影響積分值

● 曲線過零點時，可用4個點；不用，則要5個點

● 線性范圍太寬，有時意義不大