實驗概要
本實驗介紹了用LiCl法將重組質粒導入畢赤酵母菌X-33的轉化方法。
主要試劑
甘油，YPD培養基，50% PEG，1 mol/L LiCl，Sac I
主要設備
搖床，高速離心機，1.5 ml微量離心管，水浴鍋
實驗材料
重組質粒pPIC6αA-APC，畢赤酵母菌X-33
實驗步驟
1. 取畢赤酵母甘油種400 ul至50 ml YPD培養基中，30℃振蕩培養(8-10 h)至OD600~1.0；
2. 離心1500 r/min，10 min，收集新活化好的酵母細胞；
3. 再用25 ml無菌蒸餾水沖洗，室溫下1500 r/min離心10 min，棄去水；
4. 用lml 0.1 mol/L LiCl重懸細胞，轉入1.5 ml微量離心管中，高速離心(10000 r/min，15s)后收集細胞；
5. 用400 ul 0.lmol/L LiCl重懸細胞，每管50 ul分裝于1.5 ml eppendorf管中，高速離心(10000 r/min，15 s，用吸管吸去LiCl；
6. 依次加入下列試劑：240 ul 50% PEG，36 ul 1 mol/L LiCl，25 X12 mg/ml單鏈DNA，Sac I線性化pPIC6αA-APC (5-10 mg)置于50 ul無菌蒸餾水，振蕩混勻細胞，30℃靜置孵育30 min；
7. 于42℃水中熱休克20 min；
8. 8000 r/min離心3 min，吸去轉化液，用1 ml YPD重懸細胞，30℃搖床孵育(1-4h)；
9. 取200 ul上述轉化菌液于YPD固體培養基中(加入Blasticidin，再取200 ul于YPD固體培養基中(不加Blasticidin)作對照，30℃孵育2-3 d到出現轉化菌落。另取30ul新活化酵母菌液于YPD固體培養基(加入Blasticidin)作對照；再將Sac I酶切的質粒DNA 30 ul于YPD固體培養基(不加Blasticidin)作對照。30℃孵育2-3 d，觀察結果。