感染 M13 噬菌體的細菌含病毒雙鏈 RF DNA，培養基中粗提病毒顆粒中含單鏈子代 DNA，雙鏈 RF DNA 可以采用類似于質粒純化的方法從感染細胞的小量培養物中分離。從 1~2 ml 的感染細胞培養物中可以分離幾微克的 RF DNA，這個量足以進行亞克隆和作限制酶酶切圖譜。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 感染 M13 噬菌體的細菌含病毒雙鏈 RF DNA，培養基中粗提病毒顆粒中含單鏈子代 DNA，雙鏈 RF DNA 可以采用類似于質粒純化的方法從感染細胞的小量培養物中分離。從 1~2 ml 的感染細胞培養物中可以分離幾微克的 RF DNA，這個量足以進行亞克隆和作限制酶酶切圖譜。 |
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| 實驗材料 | 限制性內切核酸酶大腸桿菌培養物 |
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| 試劑、試劑盒 | 堿裂解液乙醇酚氯仿TE |
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| 儀器、耗材 | 瓊脂糖凝膠 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
堿裂解液Ⅰ
堿裂解液Ⅱ
堿性裂解液Ⅲ
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V）
含 20 μg/ml Rnase A 的 TE ( pH 8.0)。
2. 酶和緩沖液
限制性內切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠（0.8%) 懸于 0.5 X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠
4. 載體和菌株
感染了 M13 噬菌體的大腸桿菌培養物
二、方法
感染細胞的裂解
1. 在微量離心機上，將 1 ml M13 感染細胞培養物以最大轉速室溫離心 5 min，從培養液中分離感染細胞。將上清轉移至新的微量離心管，存于 4℃，感染細胞沉淀置于冰上。
2. 細胞沉淀 4℃ 離心 5 s，用自動移液器吸去殘余培養液。
3. 加入 100 μl 預冰冷的堿裂解液Ⅰ，劇烈振蕩，以懸起細胞沉淀。
4. 在管中加入 200 μl 新配置的堿裂解液Ⅱ。蓋緊蓋子，快速顛倒混合 5 次。不要振蕩。混合后置于冰上 2 min。
5. 在管中加入 150 μl 冰冷的堿裂解液Ⅲ。蓋緊蓋子，顛倒混合數次，使堿裂解液Ⅲ與黏稠的細菌裂解物混合，置于冰上 3~5 min。
6. 在微量離心機上，將細菌裂解物以最大轉速 4℃ 離心 5 min，將上清轉移至新的微量離心管。
M13 噬菌體 RF DNA 的純化
7. 加入等體積酚：氯仿。振蕩混合有機相和水相，以最大轉速離心 2~5 min 將水相 (上相）轉移至新的微量離心管。
8. 加入 2 倍體積的乙醇沉淀雙鏈 DNA。振蕩混合，室溫放置 2 min。
9. 在微量離心機上，以最大轉速 4℃ 離心 5 min 回收 DNA。
10. 輕輕吸去上清，將離心管倒置于吸水紙上，使管內液體流盡，除去吸附于管壁上的任何液滴。
11. 加入 1 ml 70% 乙醇 4℃ 離心 2 min，按步驟 10 的方法去除上清，核酸沉淀室溫干燥 10 min。
12. 為了去除微量 RNA，沉淀用含 RNase 的 TE（pH 8.0）重懸，略加振蕩。
13. 用適當的限制性內切核酸酶消化并用瓊脂糖凝膠電泳分析雙鏈 RF DNA。 |
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