MALDI質譜新方案可加速藥物研發進程

布魯克·道爾頓執行副總裁 Rohan Thakur

　　在過去的幾十年中，基質輔助激光解吸電離質譜（MALDI-MS）已經在許多應用中證明了其有效性和穩定性。最近MALDI-MS方面的創新促進了兩種檢測方案的發展，這兩種方法可以用于加速臨床前藥物的發現：一種用于超高通量篩選程序(uHTS)，另一種用于藥物分布MALDI質譜成像研究。

　　新藥研發的一貫原則 – 失敗越早，成本越低（fail early, fail cheap）– 這會驅使制藥公司在早期新藥發現過程中會選擇盡量多的化合物去“命中”，同時會在藥物的ADME/TOX(吸收、分布、代謝、排泄/毒性)的研究中快速淘汰不適合的候選藥物。新舉措無疑推動了藥物研發渠道的增長（2015-2016年），其增長率達到了11.5%。

　　超高通量藥物篩選

　　小分子研發的理想分析工具要具有無標記的表征、標記以及直接的定量測定能力。快速、高效、易用、低成本和自動化樣品制備也是大多數研發工作者對儀器的期待。新一代質譜方法本質上符合了以上多項標準，在過去幾年中也為MALDI-MS使用開辟了一個新的領域。 MALDI-MS正在幫助研究人員確定最有前景的小分子，并正在擴展到藥學領域所依賴的超高通量復合篩選項目。

　　采用超高通量篩選（uHTS）程序時，Bruker的rapifleX MALDI-PharmaPulse^TM所得結果比傳統儀器快50倍，具有更高的穩定性、靈敏度和更大的質量范圍。在2016年的ASMS會議上，Peter Marshall博士（葛蘭素史克公司，英國）等人通過海報描述了他們使用MALDI-PharmaPulse以及納升液體處理技術，每周能夠篩選超過100萬個樣品。這項工作的進行很大程度上是得益于rapifleX MALDI-PharmaPulse革命性的10 kHz激光器。

　　實驗中可以獲得80-400或700-3,500質荷比范圍內化合物的質譜圖，每個樣品有200個激光照射位點。在這些實驗條件下，該系統在7.36分鐘內處理了1536個孔板。通過大量候選化合物篩選，進行簡單的放大計算，結果表明，分析200萬種化合物僅需要7.85天。對系統和方法的穩定性進行評估，108次測量前后的結果具有良好的相關性。

　　由此，他們得出結論，uHTS的技術和方法是強大的，可以在非常短的分析時間進行大量樣品分析。該機構在一周內測量了100多萬個樣本，并據此推測儀器測量200多萬個樣本也無需清理儀器鏡片組。最后，他們期待儀器可具有更高通量的篩選能力，期待使用6144孔板也可以達到相近的測試性能。如果采用這種方法，可以將篩查200萬個化合物所需的時間縮短到2.39天。

　　小分子藥物空間分布研究

　　制藥公司越來越意識到了臨床研究結果與早期開發工作之間的脫節。作為行業性問題之一，ADME/TOX研究結果需要盡早與臨床研究整合，以便了解還處于臨床前階段的藥物分布、代謝和毒理學基本細節。

　　目前確定前體藥物及其代謝物組織分布的最佳實踐方法是定量全身放射自顯影技術（QWBA）和液相色譜-質譜聯用技術，但這些方法并不能提供完整的代謝分布圖。 QWBA研究成本很高，也不能區分前體藥物和代謝產物，對早期生物化學途徑和機制研究有很大的限制。

　　對來自組織勻漿的提取物進行LC-MS分析，并不能得到化合物空間分布信息，同時這種分析方法可能會產生較大誤差。例如，如果代謝物分布在非常小的區域，則由LC-MS報告的組織中的平均含量并不能精確地表示藥物代謝產物的真實分布情況，研究人員可能由此得出藥物毒性相關的錯誤結論。

　　MALDI質譜成像檢測方法，可以提供關于藥物、藥物代謝物和其他內源物質組織的定量和空間分布信息。MALDI-MSI可以幫助研發人員在開始成本高昂的QWBA實驗之前了解候選藥物相關代謝物的空間分布規律及其組織生理學情況，從而決定候選藥物是否應該進行下一個研發階段。

　　MALDI-MSI所采用的一系列質譜儀器類型取決于具體應用需求。例如，MALDI-TOF系統可以提供最高的通量，而磁共振質譜儀（MALDI-MRMS）可以提供極高的質量分辨率和測量準確度。另外，MALDI-MRMS通常可以對成像的化合物進行獨特的分子式識別。

　　在MALDI質譜成像中，常規的新鮮冰凍組織切片用MALDI基質溶液處理，MALDI基質溶液從組織中提取化合物，提取同時可以保留下層組織中化合物的空間信息。 MALDI-MSI分析可以生成一組從樣品中檢測到的化合物的無標記強度/分布圖。 MALDI質譜成像不會破壞內部細胞特征，隨后可以對樣本進行組織學染色以促進組織學與MSI質譜成像的綜合研究。

圖1.炎癥區域特定代謝物的組織學、MALDI質譜成像研究

　　圖1所示的圖像說明這種新技術可以為藥物ADME / TOX機制的更深入研究提供幫助。Castellino等人在早期工作中，通過MSI技術以50μm的空間分辨率對3只服用拉帕替尼的狗的肝臟代謝物進行了分析。組織學相關性分析顯示分子量為649.14的代謝物特定分布于其炎癥部位。

　　在同一課題組的最新文章中， MALDI-MSI解決了傳統LC-MS分析不能解決的問題。研究抗癌藥物達拉菲尼對幼年大鼠的腎毒性，在幼鼠腎臟切片中可以觀察到管狀沉積物，而這些沉積物成年大鼠的腎臟中并不存在。使用MALDI-MSI直接晶體進行了分析并確定它們是磷酸鈣，這與傳統的LC-MS或QWBA相比，可以提供更加完善的評估達拉菲尼的用藥風險。

　　結論

　　圍繞MALDI-MS建立的新技術和創新方法正在興起，這有助于更快地發現與篩選候選藥物，以及能夠以更低成本研究候選藥物的ADME / TOX代謝規律。許多制藥公司已經充分認識到這些新技術的價值，并進行了相關儀器配置。隨著相關新應用的不斷發布，MALDI-MS技術將在藥物的發現和研究過程中起到更大的作用。