MALDITOFMS和Vitek2Compact系統對腸桿菌科細菌鑒定能力比較

Microflex^TM MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統對腸桿菌科細菌鑒定能力的比較

引言

近年來, 革蘭陰性桿菌在臨床微生物樣本中的分離率已> 70%, 超過革蘭陽性菌, 其中三分之二又為腸桿菌科細菌^[1, 2]。腸桿菌科細菌與人類關系密切, 隨著創傷性診療技術的廣泛開展以及免疫抑制劑的廣泛應用, 由腸桿菌科細菌引起的醫院感染逐年上升。因此, 臨床對腸桿菌科細菌的鑒定需求不斷增加。臨床微生物實驗室快速、準確地鑒定此類細菌, 對于感染性疾病的診斷和治療具有重要意義。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)用于分析非揮發性生物大分子, 已運用于微生物領域, 尤其在菌株鑒定方面。本研究利用Microflex^TM MALDI-TOF MS 和Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(簡稱Vitek 2 Compact)同時對545株腸桿菌科細菌進行鑒定, 若兩者鑒定結果不一致, 再用沙門菌血清凝集試驗或細菌16S rDNA基因測序予以確認。

材料和方法

一、 材料

1. 菌株來源

上海交通大學醫學院附屬新華醫院臨床微生物實驗室以往參加衛生部和上海市臨床檢驗中心質控菌株以及2013年3至12月從各類臨床樣本分離得到的腸桿菌科細菌, 共545株。

2. 儀器和試劑

Vitek 2 Compact及配套的革蘭陰性桿菌鑒定卡(GN)購自法國BioMé rieux公司, Microflex^TM MALDI-TOF MS儀和α -氰基-4-羥基肉桂酸購自德國Bruker Daltonics公司, Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)儀購自德國Eppendorf公司, ABI Prism 310 Genetic Analyzer DNA測序儀購自美國Applied Biosystems公司, PCR擴增試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)公司, 基因測序擴增試劑盒購自美國Applied Biosystems公司, Bruker Bacterial Test Standard(BTS) 、乙腈、三氟乙酸、乙醇和甲酸購自美國SIGMA公司, 沙門菌屬診斷血清購自寧波天潤生物藥業有限公司, 麥康凱及SS平板購自上海伊華醫學科技有限公司。

二、方法

1.Vitek 2 Compact鑒定

挑取平板上純菌落, 制備0.5麥氏單位濃度的菌懸液, 用Vitek 2 Compact及其配套的GN鑒定板進行鑒定。

2.MALDI-TOF MS儀鑒定

(1)參數設置:線性操作模式, 正離子, 基質抑制偏轉模式。脈沖離子提取時間:100 ns。相對分子質量:2 000~20 000; (2)制備樣本:取待測樣本(1個菌落), 加入 300 μ L去離子水和900 μ L乙醇, 于Eppendorf離心管中充分混勻, 離心后干燥沉淀, 加入70%甲酸水溶液(1~80 μ L), 充分混勻, 加入等量的乙腈, 充分混勻, 20 817× g離心2 min, 取上清1 μ L, 滴加到MALDI靶板上, 室溫晾干。1 μ L α -氰基-4-羥基肉桂酸基質液覆蓋上述樣本點, 室溫晾干; (3)上機分析:靶板上機用flexcontrol軟件作質譜分析, 先用標準品(BTS)進行系統誤差校正, 再進行待測樣本的質譜分析。使用MALDI Biotyper 3.0數據庫進行數據比對, 評分≥ 1.7表示樣本圖譜與數據庫中的相應菌株圖譜高度相似, 結果高度可信。本研究均選取評分≥ 1.7的結果作為待測樣本的鑒定結果。

3.血清凝集試驗

沙門菌的血清凝集試驗具體操作方法見《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)。

4.基因測序

采用水煮法提取細菌基因組DNA, 以細菌基因組DNA為模板進行PCR擴增, 使用細菌16S核糖體通用引物序列16S rDNA( F:5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; R:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3')^[4], PCR體系配置按試劑盒說明書進行, PCR程序為:94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 30個循環; 72 ℃ 5 min。PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳后, 割取含1 500 bp左右清晰DNA條帶的瓊脂凝膠塊, 用DNA膠回收試劑盒回收其中的PCR產物作為測序單向PCR反應的模板, 單向PCR反應的具體體系與擴增程序參考BigDye Terminator v3.1測序試劑盒操作手冊。單向PCR反應產物經過回收后使用310測序儀進行測序得到DNA序列, 通過NCBI網站BLAST工具進行DNA序列比對分析, 得到菌株所屬分類。

結果

一、3種腸桿菌科細菌的質譜鑒定圖譜

大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌等3種臨床最常見的腸桿菌科細菌的質譜鑒定圖譜見圖1。3種腸桿菌科細菌有相同的特征峰, 如4 365、5 381和7 158 amu, 大腸埃希菌和陰溝腸桿菌相同的特征峰為6 254 amu, 也有各自特異的特征峰, 大腸埃希菌特異的特征峰2 689和5 096 amu等, 肺炎克雷伯菌特異的特征峰3 146、4 740、6 290、7 706和9 482 amu等, 陰溝腸桿菌特異的特征峰3 128、5 122、7 690、8 331和9 511 amu等。

圖1 3種常見腸桿菌科細菌的質譜圖

二、Microflex^TM MALDI-TOF MS的鑒定結果

545株細菌中鑒定到種、屬的分別為529株(97.1%)和16株(2.9%)。除了6株腸桿菌屬細菌和10株沙門菌屬細菌被鑒定到屬外, 其余菌株均被鑒定到種。見表1。

三、Vitek 2 Compact鑒定結果

545株細菌鑒定到種、群、屬的分別有454株(83.3%)、76株(13.9%)、12株(2.2%), 另有1株(0.2%)鑒定錯誤, 2株(0.4%)未鑒定出。其中鑒定到群的細菌有腸桿菌屬(54株)、沙門菌屬(10株)、變形桿菌屬(8株)、 沙雷菌屬(3株)和耶爾菌屬(1株)。鑒定到屬的細菌有腸桿菌屬(1株)、枸櫞酸桿菌屬(1株)、 拉烏爾菌屬(6株)和泛菌屬(4株)。鑒定錯誤的是1株非脫羧萊克勒菌, 未能鑒定出的是2株大腸埃希菌。見表1。

表1 Microflex^TM MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact對腸桿菌科細菌鑒定結果比較

續表 1

四、Microflex^TM MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact鑒定比對

545株腸桿菌科細菌中有83.3%(454/545)在2個系統中鑒定結果一致且均鑒定到種水平。鑒定結果不一致的91株細菌中, 75株細菌被Microflex^TM MALDI-TOF MS系統正確鑒定到種水平, 而Vitek 2 Compact則僅能將其中76株細菌鑒定到群水平。見表2。

表2 Microflex^TM MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact鑒定結果對比[株(%)]

討論

腸桿菌科細菌是一類分布廣泛且常見的醫院感染病原菌, 可引起泌尿道及傷口感染、血流感染、肺炎、腦膜炎等, 受到臨床日益關注。目前, 在醫院臨床微生物實驗室中, 腸桿菌科細菌的傳統鑒定方法主要有手工板條法和儀器法, 儀器法中以Vitek 2 Compact最為常見, 它們都是依據細菌生化反應結果進行鑒定, 時間長且成本高。MALDI-TOF MS技術作為一種新型的微生物鑒定方法, 依據特征性蛋白圖譜進行分類和鑒定, 已在微生物領域尤其細菌鑒定中得到廣泛運用。

本研究采用Microflex^TM MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact同時對545株腸桿菌科細菌進行鑒定, 結果不符的菌株用沙門菌血清凝集試驗或細菌16S rDNA基因測序予以確認。這2種儀器對細菌種的鑒定符合率分別為97.1%和83.3%。在Vitek 2 Compact數據庫中, 由于陰溝腸桿菌、霍氏腸桿菌和路德維希腸桿菌包括在陰溝腸桿菌復合群, 普通變形桿菌和潘氏變形桿菌同屬一個復合群, 液化沙雷菌和小腸結腸耶爾森菌分別歸于液化沙雷菌群和小腸結腸耶爾森菌群, 導致這些細菌只能鑒定到群; 同樣由于數據庫原因, 分散泛菌只能被鑒定到屬。而Microflex^TM MALDI-TOF MS儀數據庫中包含的腸桿菌科細菌參考圖譜種類比Vitek 2 Compact細菌數據庫多, 因此, 前者對這些細菌都能正確鑒定到種。在14株沙門菌株中, Microflex^TM MALDI-TOF MS對豬霍亂沙門菌、鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌能直接鑒定到種, Vitek 2 Compact則對甲型副傷寒沙門菌、傷寒沙門菌和腸炎沙門菌亞利桑那亞種直接鑒定到種, 其余菌株都只能鑒定到屬或群, 需用沙門菌血清凝集試驗進一步確認。有2株大腸埃希菌在Vitek 2 Compact上未能鑒定出, 分析其原因可能由于其菌落特別黏稠, 不易制備成均勻的菌懸液, 致使其不能準確鑒定。由于Microflex^TM MALDI-TOF MS數據庫中志賀菌屬的數據缺乏, 因此, 本研究不包括志賀菌屬的鑒定結果。

本研究結果顯示, Microflex^TM MALDI-TOF MS對于腸桿菌科細菌的鑒定符合率高于Vitek 2 Compact。隨著方法改進和數據庫完善, Microflex^TM MALDI-TOF MS對細菌的鑒定符合率將進一步得到提高, 而且其操作簡便、快速, 成本低, 可以滿足臨床微生物實驗室對腸桿菌科細菌的快速鑒定需求, 為臨床進行有效、及時的抗感染治療提供幫助。