MTT原理、步驟與結果分析方法及注意事項

MTT分析法以活細胞代謝物還原劑3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑藍為基礎。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下 tetrazolium環開裂，生成藍色的formazan結晶，formazan結晶的生成量僅與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT還原）。還原生成的formazan結晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶標儀測定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數目。也可以用DMSO來溶解。
MTT粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。
MTT
步驟如下：
1、接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000－10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。
　　2、培養細胞：同一般培養條件，培養3－5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。
　　3、呈色：培養3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS <ph=7.4>配)20ul。繼續孵育4小時，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加 150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。
　　4、比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
注意事項：
1、選擇適當得細胞接種濃度。
2、避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。
3、設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。
MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！
舉個例子：
各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21、0.06。代入計算公式：
Pm=0.95
　　Pn=0.06
　　P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
　　 Xm=lg0.1=-1
　　lgI=lg0.1/0.01=1
　　 lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
　　IC50=0.00025
參考公式：
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
　　Xm:lg 最大劑量
　　I:lg(最大劑量/相臨劑量)
　　 P:陽性反應率之和
　　Pm:最大陽性反應率
　　Pn:最小陽性反應率
抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值
　　公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率
例：
用96孔板培養SMMC-7721肝癌做MTT測細胞活力，應該加多少1640培養基，多少MTT和DMSO合適?根據書上說的加 200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO加DMSO之前要盡量去掉培養液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定，一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。