使用熒光探針的質膜染色技術
真核細胞質膜（PM）是脂質雙層，組織成一個連續的屏障，將細胞環境與細胞外空間分隔開, 由質膜提供的物理屏障還用作蛋白質的生物支架，這些蛋白質介導信號轉導或引發細胞響應（例如Ras 1），以響應細胞表面發生的細胞外事件。除了這些功能，PM還通過釋放和接收被稱為細胞外囊泡（EVs）2的封裝生物分子，充當細胞間樞紐。質膜的諸多重要作用，使得通過熒光標記質膜來研究質膜功能變得越來越普遍。
今天給大家總結一下常用熒光膜探針的優缺點，并概述了最新膜探針突破，發光膜探針通過結合在質膜附近或質膜內來描繪細胞的外圍。平常我們用的最多的有五類膜探針：小麥胚芽凝集素（WGA）偶聯物，脂質偶聯物，親脂性染料，共價結合探針和生物物理報告探針，下面我們來對這五種常見探針做一個簡要介紹：
1. 小麥胚芽凝集素（WGA）
WGA是一種凝集素，可優先結合細胞表面聚糖N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神經氨酸。這些碳水化合物通常附著在蛋白質上，它們的定位可間接顯示細胞膜。現在，目前WGA標記物利用Alexa Fluor綴合技術，可以對細胞表面多糖標記物進行定位，從而使科學家能夠間接檢測質膜。熒光團偶聯的WGA探針也有顯著缺點：表面多糖可以隨細胞膜的組成而變化，從而在特定的細胞群體之間導致細胞間染色差異。此外，偶聯的WGA由于其較大尺寸限制了其擴散，因此無法有效地染色3D培養細胞和組織。
2. PKH
PKH染料具有碳鏈，該碳鏈將熒光團插入并錨定在質膜的脂質區域，PKH染料可標記活細胞中的質膜，據報道其半衰期為5-100天，染色的必需配有專們等滲試劑。花青Paul Karl Horan（PKH）染料的化學作用使質膜的特定標記成為可能，而無需膜表達因子。當前，由PKH2，PKH26和PKH67組成的可用PKH染料具有從504 nm到567 nm的有限發射光譜，插入染料后，需要通過添加血清或BSA蛋白來完成染料淬滅步驟，無法淬滅未結合的染料會導致染料聚集并進入共培養或導致細胞結塊。相關最新研究數據表明，用PKH26標記會引起外泌體腫脹，這可能會改變外泌體的正常分布和細胞攝取。通常，由于不良的水溶性，PKH標記效率低，需要相對較高的濃度來實現有效的膜染色。
3. 長鏈花青染料
長鏈親脂性花青染料DiI，DiD，DiA，DiR和DiO是眾所周知的質膜染料，涵蓋了廣泛的激發/發射光譜。DiO； DiOC 18（3））在501 nm處出現熒光峰，DiI在565 nm處峰，4- Di -10- ASP在590nm處，DiD在665nm處， DiR '; DiIC 18（7））在780nm處達到峰值。盡管這些碳花青染料廣泛覆蓋可見光譜范圍，但它們實際上不溶于水。因此，它們在水溶液中強烈聚集，產生難以控制的細胞膜染色。例如，DiO無法對DiA成功染色的組織染色，而DiI可以有效地標記膜，但是遠紅外DiD會產生點狀染色。同時在需要Triton-X 100來增加細胞通透性的共標記應用中，花青染料也不兼容。
4. MemGlow?探針
用MemGlow?探針標記的活HeLa細胞. 圖片由Mayeul Collot等提供. 2019.
MemGlow?系列探針（圖1）提供了一種新的磷脂膜染色解決方案，它由5種基于熒光花青的質膜探針組成，具有寬光譜范圍，包括近紅外（Ex: 499-689 nm，Em: 506-713nm）3。
MemGlow?探針具有其原始花青或BODIPY母體染料的許多優秀的特性，同時在某些應用中顯示出比同類產品更高的標記效率。MemGlow?560和640探針的優點是基于花菁對稱的化學結構，通過兩個兩性離子錨的化學連接進一步增強了這些結構。類似地，MemGlow?488是一種兩親性調節的BODIPY探針，通過添加兩性離子錨來增強，以提高對細胞膜的特異性，使其超過了親本BODIPY染料。兩性離子錨促進了探針聚集體在質膜中的解離和嵌入，同時增強了它們的保留能力（圖2）。
圖2. MemGlow?探針的開啟機制. MemGlow?探針是自淬滅的，直到插入質膜才能使納米粒子激發熒光。