Nature發布突破性CRISPRCas9新技術

　　 一種改良版本的新型基因編輯CRISPR-Cas9核酸酶似乎可以強有力地消除當前這一技術一個非常重要的限制：不必要的脫靶DNA斷裂，將它們降低至無法檢測到的水平。在發表于《自然》（Nature）雜志上的研究論文中，麻省總醫院（MGH）的研究人員描述了改造Cas9酶，減少它與靶DNA的非特異性互作，大大擴展這一基因編輯技術應用的過程。

　　 論文資深作者、麻省總醫院病理學系研究員及研究副主任J. Keith Joung博士說：“我們構建出了一種Cas9變異體，它可以將脫靶效應降低至即使采用最敏感的方法我們也無法檢測到的水平，是朝著實現臨床應用，即不在基因組中其他地方造成損傷的情況下精確擊中靶點，而取得的一項重大進展。由于脫靶效應有可能擾亂試驗結果，其對于研究應用也將產生極其重要的影響。因此，我們預想我們的高保真變異體將替代標準的Cas9用于許多研究和治療應用中。”

　　CRISPR-Cas9核酸酶是由細菌DNA切割酶Cas9與一條可以結合靶DNA序列的短鏈導向RNA序列所組成，當前人們主要利用它來生成靶向性DNA斷裂，由此導入一些遺傳性改變。盡管相比以往的基因編輯工具更容易使用，CRISPR-Cas9核酸酶具有一個非常明確且重要的限制。正如Joung和其他研究人員在2013年的一些研究中所描述的那樣，CRISPR-Cas9核酸酶可以誘導與目標序列相似的一些位點發生脫靶DNA斷裂。Joung研究小組和其他的團隊隨后開展的一些研究雖然減少了這些脫靶效應，但卻未完全及一致地消除它們。

　　Joung和同事們猜測，減少Cas9與靶DNA之間的互作或許可以更完全地消除脫靶效應，同時保留期望的目標互作。這一研究小組將焦點放在了這一事實上：Cas9酶自身的某些部分可以與目標DNA分子的骨架互作。追蹤共同主要作者、麻省總醫院病理學博士Vikram Pattanayak最初的觀察結果，研究小組通過將結合DNA骨架的長氨基酸側鏈換成無法生成這樣的連接的短鏈，改變了Cas9介導的4個接觸位點。

　　Pattanayak說：“我們以往的研究工作表明，Cas9有可能利用比其所需更多的能量結合了它的目的靶DNA位點，造成了一些不完全匹配的脫靶位點發生非必要的切割。我們推斷，通過在這4個位點進行替換，我們可以除去一些能量在消除脫靶效應的同時保留全部的靶向活性。”

　　共同主要作者、麻省總醫院分子病理學部Benjamin Kleinstiver博士，與Joung實驗室研究技術人員Michelle Prew一起，隨后任意組合改變1條、2條、3條或4條氨基酸側鏈，測試了總共15種可能的變異體，發現了一種三個位點發生替代的變異體，和一種四個位點發生替代的變異體似乎顯示出最大的前景，能夠在區別出錯誤匹配靶位點的同時保留在人類細胞中的全部靶向活性。

　　研究人員隨后更充分地確定了4條側鏈發生替代的這一變異體的特征，他們將這一變異體命名為SpCas9-HF1（SP代表化膿鏈球菌，是這一廣泛使用的cas9的來源，HF代表高保真）。他們發現相比于未改變的原始SpCas9，在他們測試的37種不同的導向RNAs中，這一變異體采用85%的導向RNAs誘導出了靶向效應。利用Joung實驗室在2014年開發出的一種檢測全基因組CRISPR-Cas9脫靶效應的高度敏感系統：GUIDE-Seq，該研究小組發現組合未改變的SpCas9與7種不同的導向RNAs誘導出了多達25個脫靶突變，而采用SpCas9-HF1與其中的6種導向RNAs則未生成可檢測到的脫靶效應，采用第7種導向RNA只生成了一個脫靶位點。利用靶向深度測序實驗進一步證實了這些結果。

　　Joung的研究小組還發現，當靶向以1或2種核苷酸構成的重復序列為特征的非典型DNA位點時——這些位點通常容易發生許多脫靶突變，SpCas9-HF1可以減少脫靶效應。他們還開發出了其他的SpCas9-HF1衍生物：HF2、HF3和HF4，它們可以消除在采用HF1變異體和少數導向RNAs時少數殘余的脫靶效應。“如果利用某一導向RNA，SpCas9-HF1仍然生成了少數尤其難以消除的脫靶效應，或許設計出一些新變異體能夠除去這些效應，”Joung說。

　　研究人員還證實像天然的相似物一樣，SpCas9-HF1能夠結合其他有用的改變來擴展其功用。Joung實驗室去年夏天發表在Nature雜志上的研究工作表明，誘導一系列氨基酸替換可以擴大未改造SpCas9的靶向范圍。在當前的研究中，作者們證實在SpCas9-HF1中導入相同的改變也可以擴大這種高保真變異體的靶向范圍。“這些結果顯示，這些變異體可被當前使用CRISPR-Cas9技術的所有人廣泛地使用。它們可以很容易地用于替代野生型SpCas9，并為將脫靶突變降低至無法檢測到的水平提供了一種高效的方法。”