Nature綜述丨冷凍電鏡在藥物發現中的應用前景

　　1前言

　　近日，歐美多國科學家在Nature Reviews Drug Discovery雜志發表了題為Cryo?EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects的重要綜述，系統闡述了Cryo-EM（Cryo-electron microscopy）的前世今生，以及它在藥物篩選方面的應用前景【1】。

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　　眾所周知，2017年諾貝爾化學獎授予了三位杰出的生物物理學家Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson，以表彰他們在Cryo-EM發展過程中的推動性貢獻。有了他們，眾多生物學家的工作才如行云流水，探囊取物似的發文（特約評論丨2017年諾貝爾化學獎評述——冷凍電鏡技術獲獎并不意味著該技術已經成熟）。

　　結構生物學似乎一直被很多人，甚至被很多“吃瓜群眾”所詬病。不少人認為結構生物學就是“灌水+搬磚”，覺得結構生物學領域發高水平文章很容易，其實不然。外行看結構生物學，可能大部分僅停留在結構表面，對結構生物學的應用和對科學問題的闡述缺乏深入的了解和認識。顏寧老師曾說過，“拿到一個結構只是一個起點，從結構里去發現大自然的奧秘才是結構生物學的精髓所在！”

　　其實結構生物學的重要性毋庸置疑，這一點可以從近幾年（如2003、2006、2009、2012）的諾貝爾獎直接授予結構生物學家看出。這些諾貝爾獎獲得者也并非一直從事結構生物學研究，比如說2012年諾貝爾化學獎得主Brian K. Kobilka最初從事細胞生物學，后來轉行從事結構生物學研究分子機制 (https://www.nature.com/-news/2011/110824/full/476387a.html），因為他覺得他的科學問題只有結構生物學才能解答，才能從原子水平解釋G蛋白偶聯受體（GPCR）的分子機理。另一方面，結構生物學在藥物篩選中也起著舉足輕重的作用。

　　2三足鼎立的時代

　　目前的結構生物學的三大手段分別是X-ray晶體衍射、核磁共振（NMR）和Cryo-EM。X-ray晶體衍射在這三種方法中一直是占主導地位，在PDB數據庫中，晶體結構大約占總數的90%，NMR結構占9%，剩下EM結構僅占不到1%（圖1）。盡管如此，這三種技術各自有各自的優勢和地位。

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　　X-ray晶體衍射主要覆蓋的蛋白分子大小在10-150 kd，超過150 kd的晶體結構非常少，不過大部分蛋白都在這個分子量范圍內。該技術經過幾十年成熟的發展，已經解析了12萬多個蛋白結構，如今想找一個容易結晶的重要蛋白可不易。

　　NMR技術主要覆蓋的蛋白分子小于50 kd，可以直接對溶液中的蛋白進行結構解析；不過它對蛋白的表達量和穩定性要求很高，所以可以繼續深入發掘的潛力有限。

　　Cryo-EM技術近些年來才興起，經過近幾年的飛速發展，倒是大有取代X-ray晶體衍射方法之勢【2-4】（0.73?，最高分辨率的結構揭示淀粉樣聚集蛋白功能性可逆的精密調控分子機制）。不過目前來說，Cryo-EM的蛋白結構主要是大于150 kd的大蛋白或復合物，而且分辨率3 ?以下的還是少數，但是這一現狀正在改觀。

　　圖1. 結構生物學三種方法解析的結構比例

　　3結構生物學在藥物篩選中的應用

　　結構生物學一直在藥物設計中扮演著重要的角色，它可以用于臨床前藥物設計的每一步，包括藥物靶點的設計和鑒定，先導化合物優化等。由于能提供直接的證據，所以往往在篩藥初期，可以對藥物設計提供可靠的靶點，為小分子藥物指明方向；在后期，直接提供結構生物學的證據，起到畫龍點睛的作用。

　　結構生物學的三大方法對藥物設計均有很大的幫助，但是也各自有各自的優缺點。X-ray晶體學是目前來說最高效、最強大，也是實際作用最大的方法，當靶點是可結晶的蛋白，一旦強大的結晶系建立，就可以快速和可重復地產生高分辨率結構，就可以源源不斷的對蛋白進行位點突變或藥物設計了；核磁共振（NMR）允許快速識別和分類，并提供有關系統動態的信息，但是該方法本身受到很多因素的限制，比如目標蛋白的覆蓋范圍不是特別廣泛；Cryo-EM允許在溶液中確定大的和/或動態的大分子復合物的結構，而不需要獲得晶體，甚至在它們的天然狀態下即可實現，比如翻譯后修飾的狀態；此外，由于蛋白在接近天然狀態下的溶液中是高度動態的，所以蛋白的不同構象狀態可以在一個實驗中解決。

　　Cryo-EM已經證明了其在靶標鑒定、驗證等方面的實用性，通常涉及目標結構分析，以理解作用機制和評估可藥用性。該分析需要參考天然的結構，理想情況下會結合其他方法的結果作為參考。自20世紀90年代以來，Cryo-EM已與X-ray晶體學結合使用了幾十年，以解決不易結晶的大型復合物的結構。從EM密度圖的輪廓獲得的低分辨率分子包絡（通過使用與對象的分子質量相關的閾值以去除與噪聲對應的三位像素）可以給高分辨率晶體結構域、個別蛋白質或復合體提供近似輪廓，可與X-ray晶體學相輔相成。

　　結構生物學在藥物開發中的應用，最好的例子當屬GPCR了【1, 5, 6】。在2007年GPCR結構解析之前，藥物篩選基本上就是處在盲篩和半盲篩的階段。有了晶體結構之后，臨床藥物的開發迅速發展，上市藥物也全面發展（圖2）。

　　圖2. a.近年來GPCR的臨床階段中的藥劑數量；b. 每種受體配體類型在所有結晶GPCR中的比例 【6】

　　4Cryo-EM技術的歷史與現狀

　　1931年，Max Knoll和Ernst Ruska發明了電子顯微鏡，并在1933年第一次打破了光鏡的理論極限，使人類能夠看到更加細小的顆粒。在發明之初，電鏡并不被看好被用于對生物樣品的觀測。因為兩個基本的問題擺在生物學家面前：一是電鏡成像時，需要在真空中；二是成像時電子的輻射對生物樣品的損傷很大。所以在之后的幾十年里，科學家僅僅是用它做一些細胞形態學、病毒顆粒之類的負染，除此外，電鏡在生物領域的貢獻不太大。

　　但是技術瓶頸總是阻擋不住科學家求真的腳步！1981年，Jacques Dubochet和他的同事在電鏡技術上取得了突破性進展——他們將快速冷凍的方法引入其中，即，將單個分子快速冷凍在單層的玻璃態的水（或者叫無定形的冰，vitrified water）中，即可解決上述兩個基本問題。玻璃態化（Vitrification）的過程不僅可以使樣品保持天然的狀態，還可以保護樣品在低溫成像時免受脫水的危險，而冷凍本身也減少了由電子束引起的傷害。

　　盡管如此，在當時，要使電鏡成像達到原子分辨率水平，還依然面臨諸多挑戰。比如說低信噪比、如何將2D成像轉化為3D結構等問題。Joachim Frank和他的同事率先使用計算圖像處理技術（computational image processing techniques），利用多個成像生物大分子拷貝的計算平均來改善信噪比的問題，得到不同角度的2D圖像，再利用計算機軟件進行3D重建，解析蛋白質的結構。近些年來眾多的設備改善也極大促進了Cryo-EM技術的發展，比如高自動化程序的軟件開發、高性能charge-coupled device（CCD）相機的應用等。正是由于這些技術的使用，Cryo-EM的應用才越來越廣泛。

　　從電鏡發明開始至今，解析的生物樣品的結構大約有2200個（蛋白結構、病毒顆粒等）。1968年，第一個電鏡結構被解析；1981年，有了冷凍樣品的電鏡技術；1999年，使用電鏡技術解析的ribosome分辨率達到7.5 ? 【3】。大約2000年之后，電鏡結構的數量開始逐年增長，但那時的分辨率一直不佳；而在2010年之后，用電鏡技術解析的生物樣品結構開始井噴式增長，2010年首次超過50個，分辨率也接近原子分辨率或近原子分辨率。目前總量已經接近2200個（圖3） 。相信未來增長的勢頭會更加迅猛。

　　圖3.Cryo-EM結構增長情況。數據來源于PDB數據庫，截至2018年6月13日）

　　5Cryo-EM技術在藥物篩選中的應用前景

　　最近，單顆粒Cryo-EM為不適合結晶的蛋白提供了高分辨率結構，包括大型動態復合物和膜蛋白，技術進步使得Cryo-EM可用于研究更小的物體和分辨率更高的物體，包括與小分子的復合物。本節將通過幾個例子重點介紹具有藥物發現相關性的Cryo-EM結構。

　　5.1膜蛋白

　　GPCRs。GPCRs是最豐富的細胞表面受體蛋白，并且被市場上約30％的藥物所靶向 【5, 6】。盡管GPCR的X-ray晶體學研究取得了重大進展（這在歷史上一直是非常具有挑戰性的），但由于需要獲得高質量晶體和純化過程中相對較低的穩定性，X-ray對該家族的一些成員仍然難以應付。然而，cryo-EM可以確定GPCRs的不同構象以及與G蛋白復合物的結構，從而用于配體篩選或設計藥物。以前，構象不穩定且不能結晶的大復合物無法成像，Cryo-EM則使其成為可能。2016年，單顆粒cryo-EM解析了第一個GPCR的cryo-EM結構（4.1?），確定了激活狀態下鮭降鈣素、G蛋白和人降鈣素受體（B類GPCR）的異源三聚體結構【7】。此后不久，結合兔胰高血糖素樣肽（glucagon-like peptide 1, GLP1）、G蛋白和GLP1受體（B類GPCR）4.1 ?的cryo-EM結構被解析，解釋了B類受體如何通過激素活化結合【8】。人類GLP1受體結合的激動劑和G蛋白異源三聚體的3.3 ?的Cryo-EM結構，給出了偏向激動作用（biased agonism）的見解【9】（圖4）。分子量為150 kDa時，這種重要的藥物靶點曾經被認為幾乎不可能在近原子分辨率下使用cryo-EM成像，直到最近這些GLP1受體結構被解析出來。這些結構側鏈清晰可辨，可幫助設計治療II型糖尿病和肥胖癥的新藥，同時也為以后的更高分辨率GPCR蛋白復合物的解析提供了很好的樣本范例。

　　圖4. 偏向信號（Biased signalling）可以通過三種通用機制進行編碼【5】

　　γ-分泌酶（γ-secretase）。γ-secretase是涉及淀粉樣-β肽裂解的四組分170 kDa的膜內蛋白酶。γ-secretase的功能障礙是促進早發性阿爾茨海默病（AD）患者大腦中淀粉樣斑塊形成的原因，因此科學家有興趣將其作為潛在的藥物靶標。γ-secretase也作為Notch信號傳導的關鍵介質參與癌癥。在分辨率為3.4 ?的γ-secretase的cryo-EM結構中發現，四跨膜束內核（core of a four-transmembrane bundle）的兩個熱點突變，削弱了蛋白酶活性，從而引起早發性阿爾茨海默病。這個原子模型可以幫助設計更具選擇性的化合物。值得注意的是，γ-secretase糖基化對Cryo-EM數據集的結構重建幾乎沒有影響，而它卻可能妨礙X-ray的結晶【10】。

　　離子通道。各種離子通道結構已經在不同的分辨率下得到了解決，包括幾種潛在的藥物靶標。 這些包括：瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員1（TRPV1）【11-13】和TRPA1【14】通道，它們分別參與傳感和傳導溫度和刺激物；電壓門控鈣通道Ca v1.1【15】和鈉通道NavPaS【16】，它們分別涉及骨骼肌組織的收縮以及可興奮細胞中動作電位的產生和傳播。被解析的通道蛋白還有很多，特別要指出的是，冷凍電鏡最近對TRP家族中的通道蛋白研究產生了巨大的影響，在過去的4年中，約解析出了50個冷凍電鏡結構。歷史上，獲得良好衍射的TRP通道晶體非常困難，因為它們在細胞中的基因表達水平低，并且對化學和物理刺激非常敏感。結合激動劑的TRPV1（2.9 ?）【13】，TRPML3（2.9 ?）【17】和TRPM4（2.9 ?）【18】結構是目前為止由Cryo-EM解析的膜蛋白的最高分辨率結構。同樣重要的是，Cryo-EM在研究極大離子通道復合物也具有無可估量的價值，如Ryanodine受體（RyRs）【19, 20】，它們是已知最大的離子通道之一，質量為2.2 MDa，介導細胞內Ca2+釋放并且是心臟疾病的新興治療靶點。這些解析出來的離子通道蛋白結構，將成為藥物設計的重要靶點，同時也再次證明了Cryo-EM技術的強大。

　　ATP結合蛋白（ABC）轉運蛋白。Cryo-EM也揭示了X-ray衍射難以處理的其他膜蛋白復合物的結構。例如解析并闡明真核ABC轉運蛋白多藥耐藥相關蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1, MRP1）識別底物以及底物結合如何刺激ATP水解的機制【21】。ABC轉運蛋白在多種藥物的吸收，分布，代謝和消除中發揮關鍵作用，可導致藥物相互作用，因此，有關其結構的信息可能對藥物開發同樣具有重要價值。

　　5.2抗體和疫苗

　　要理解潛在生物治療劑作用機制，必須通過表位作圖分析闡明單克隆抗體（mAb）的活性。近年來，負染和cryo-EM已用于抗體的線性和構象表位作圖。該方法僅需要微克量的抗體-抗原復合物，并且可以與其他表位定位技術結合使用，如氫-氘交換質譜（HDX-MS）或蛋白的快速光化學氧化（FPOP）技術。在最近的例子中，Long和他的同事使用cryo-EM闡明了病毒中和人mAb是如何結合病毒樣顆粒，并阻斷病毒和宿主膜融合的機制的【22】。Ciferri及其同事使用負染技術研究與HTRA1（一種與年齡相關的黃斑變性有關的絲氨酸蛋白酶）形成獨特復合物并抑制其酶活性的抗體的結構【23】。該研究突出了IgG-HTRA1復合物的籠狀結構，其較不緊湊的螺旋槳狀排列，具有比Fab對應物更高的效力【23】。使用新的cryo-TEM技術可以進一步使表位作圖更高效地輔助mAb設計。在抗體疫苗研究中使用cryo-EM的報道還有不少，該技術在研究動態目標中起著非常大的作用。

　　5.3潛在的先導化合物優化

　　目前藥物研發人員非常感興趣的一個問題是，Cryo-EM是否可用于藥物設計的命中導向和前導優化階段，這往往依賴于基于結構的藥物設計（structure-based drug design，SBDD）。為了使SBDD在這些階段發揮作用，在短時間內（與候選藥物開發時間相比）快速而夯實地產生多種結構的流程是先決條件；而當目標可以結晶時，高通量X-ray晶體學一直是黃金標準——用一系列化合物與蛋白共結晶或浸泡法來產生共晶體，再通過同步輻射光源進行衍射數據收集，以高通量自動化方式進行分子置換和配體模型構建，產生多重化合物-靶標復合物的結構。為了有效利用結構信息進行藥物設計，分辨率理想情況下應該小于2.5 ?。

　　盡管最近在Cryo-EM方面解析的靶標復合物結構分辨率能夠低于3 ?，但它還遠沒有X-ray高效。例如，一個限制是獲得高分辨率Cryo-EM結構所需的時間框架仍然比X-ray晶體學慢幾個數量級。盡管如此，一些例子說明了如果可以解決這些限制，Cryo-EM的潛力將是非常可喜的。Merk和他的同事確定了異檸檬酸脫氫酶（93 kDa）的3.8?分辨率下的cryo-EM結構，并在結構上表征了小分子抑制劑結合引起的構象變化。Wong和他的同事確定了結合抗原生動物藥物吐根堿【24】和甲氟喹【25】的惡性瘧原蟲80S核糖體的Cryo-EM結構，并且分辨率都達到了3.2 ?。

　　盡管在設計新的先導化合物中使用Cryo-EM的例子尚未見報道，但一些有希望的結果和正在進行的技術改進表明，Cryo-EM很快將被考慮作為SBDD的一個關鍵工具，特別是對難以結晶的目標，如膜蛋白。隨著Cryo-EM產生的近原子分辨率結構的比例增加，相信制藥行業的興趣和期望也會越來越高。

　　5.4其他蛋白

　　除了膜蛋白之外，Cryo-EM在獲得對神經退行性疾病靶標蛋白的結構理解方面也取得很多進展。最近的成功例子是，從阿爾茨海默病患者的腦中分離出了第一個高分辨率結構（3.4-3.5?）的tau蛋白細絲【26】，其特征是成對螺旋絲（PHF）和直絲（SF）組成的神經原纖維tau聚集體。PHF和SF的Cryo-EM結構揭示了tau聚集體分子構象異構之間的差異，發現了異構體如何被摻入到長絲中。這些細絲的高分辨率結構測定開啟了基于結構的藥物發現的新的可能性，例如設計特定的抑制劑。

　　6藥物篩選中X-ray晶體學與Cryo-EM的比較

　　與Cryo-EM相比，X-ray晶體學在藥物篩選方面的關鍵優勢在于，能夠快速提供高分辨率結構數據。一旦建立了合適的結晶系統，通過X-ray晶體學快速連續獲得后續結構或篩選化合物所需的時間非常短：1小時內可以通過結晶自動工作站設置約2,000個結晶條件，2-3個小時即可評估所有圖像以確定合適的結晶條件（可以通過圖像識別軟件來降低）。在同步加速器上采集一套完整的晶體數據不到2分鐘，隨后的數據整合、結構解析和蛋白質-配體復合物的精修已經很大程度上已經實現自動化，并且通常可以在1小時內完成。然而，篩選以確定EM的合適樣品和冷凍條件時，1次分析僅能評估12個樣品，而為了充分表征它們又需要3-4個小時，與X-ray相比慢了好幾個數量級。

　　重要的是，這意味著X-ray晶體學的通量對于藥物配體篩選足夠快。目前，用不同化合物浸泡的約500個晶體的數據可以在24小時內收集（例如，在英國Diamond synchrotron的XChem線站；上海SSRF的BL17U和BL19U1也有此潛力），并且可以在在1周內在線處理和精修好（視結構解析者的數量和熟練程度）。 為了實現相同的目標，EM則需要大約半年的時間收集數據（假設每套數據8小時），并且至少需要一年的計算和模型構建。即使有這些樂觀的時間尺度假設，使用Cryo-EM的配體篩選過程也比使用X-ray晶體學的要慢2-3個數量級。

　　正如前文指出的那樣，cryo-EM的一個關鍵優勢是：它可以很容易地用于確定其天然狀態下的大分子和/或動態大分子（包括膜蛋白）的結構，包括翻譯后修飾。Cryo-EM對蛋白質的需求通常比X-ray晶體學更少，這對于要求苛刻的蛋白質可能是特別有利的。事實上，對于在藥物研發中使用X-ray晶體學，獲得合適的晶體仍然是一個關鍵挑戰，有延遲項目的風險，特別是膜蛋白，重糖基化蛋白和大型或柔性蛋白或蛋白復合物，能否持續獲得穩定、可靠、質量上乘的晶體存在很多不確定因素。為了應對這些挑戰，人們已經開發了許多方法，例如將大的藥物靶標減少到單個結構域，以期促進蛋白質生產，純化和結晶。所以，在結構化指導的藥物發現項目開始時，對時間和資源的投入往往是強制性的，以確保在篩選數百種化合物時具有足夠的通量。

　　Cryo-EM的另一個重要優點是相位信息可以在重建結構和實驗中直接獲得，而相位信息在X-ray晶體學中丟失，必須通過實驗進行相位重構，這取決于實驗數據的準確性采集。因此，尤其是對于4-7.5 ?范圍內的分辨率水平，通過Cryo-EM確定的結構，通常能夠以無法通過X-ray晶體學獲得的清晰度顯現單個結構域和二級結構單元。但是，分辨率超過3 ?時情況不同。只有一小部分已發表的Cryo-EM結構有超過3 ?的分辨率，并且在許多情況下，從Cryo-EM獲得的3D圖譜無法在質量上與通過X-ray晶體學獲得的圖譜在類似的分辨率下競爭。不過，在這一方面應該指出的是，X-ray晶體學和Cryo-EM的分辨率基于的方法差異很大，因此很多時候不能直接比較（見下一部分）。

　　7X-ray晶體學和Cryo-EM的分辨率比較

　　在X-ray晶體學中，基于晶格的光子最大衍射、統計學、電子密度圖譜與原子模型比較等標準直接度量分辨率【27】。在Cryo-EM中，傅里葉殼層相關函數（FSC）通常被用作主要的分辨率確定工具，用兩個獨立確定的三維圖譜的一致性來衡量兩個獨立確定的三維圖譜。分辨率由相關性下降到特定閾值（通常為0.143）以下的空間頻率確定。FSC代表數據處理的自我一致性測量；因此，在Cryo-EM密度圖中觀察到的結構特征有時可能會偏離他們應該看到的分辨率期望。下圖中顯示了這一點，其中包含一系列Cryo-EM圖，顯示了在不同模擬和實際計算分辨率下可視化的芳香族和非芳香族殘基（圖5）。

　　圖5. 芳香族和非芳香族殘基的EM密度圖

　　FSC是一種全局措施，因此僅提供一個平均分辨率值，考慮到大分子的結構柔性和典型的Cryo-EM輻射圖中的非各向同性分辨率分布，這其實是誤導性的。在最佳定義的密度圖區域中，分辨率可能被低估；而所有Cryo-EM密度圖的結構特征比FSC所指示的分辨率低得多。同樣值得注意的是，FSC沒有提供關于計算3D圖譜給定質量的信息。

　　目前，有許多提交數據庫的Cryo-EM結構報道有約3.5 ?的分辨率，與3.5 ?分辨率的X-ray晶體結構相比，它們的結構特征更為明確（在其結構明確的區域）。這部分是因為如上所述，FSC的全局分辨率低估了明確界定的特征分辨率。然而，這也是因為在分辨率>3.5 ?時，X-ray晶體學的結構解析在技術上是很困難的。其原因在于X-ray晶體學的觀測參數比較差。因此，從采集的幅度數據進行相位重構效率低下，這反映在這些分辨率下的差的數據質量上。當晶體學數據處理變得越來越自動化和可靠時，這種情況在較高分辨率下會反轉。相比之下，與3.5-4 ?分辨率范圍內的結構相比，更高分辨率的結構測定（<3?分辨率）在Cryo-EM中困難得多。Cryo-EM結構測定中有幾個參數可能會導致這種影響。例如，區分可能屬于給定大分子復合物不同構象的粒子圖像是非常困難的--隨著一個樣品中存在不同狀態的數量，這個問題變得越來越突出。諸如光束損傷和電子光學像差等其他效應也越來越限制高分辨率結構測定（<2.5?）。當想確定<2 ?分辨率下的可靠結構時，軸向彗形像差將成為Cryo-EM中主要的分辨率限制像差。

　　8Cryo-EM技術的未來展望

　　8.1目前Cryo-EM技術的瓶頸

　　處理較小的蛋白。Cryo-EM一直被認為是只能適用于分子量大于500 kDa的生物大分子，然而，很多的藥物靶點都是比這小的多的蛋白或者蛋白復合物。近年來技術的發展，理論上可以使Cryo-EM的樣品小于65 kDa，實際上也確實在這方面有很多很大的突破。因此，越來越多的小于200 kDa的高分辨結構被解析出來。

　　樣品制備的優化和數據分析。盡管Cryo-EM對樣品的均一性沒有X-ray那么高，但是樣品的均一性還是保持樣品完整度的重要保證。不均一的樣品對后期數據處理非常艱難，而且也有可能使得數據的分辨率和結構信息的完整度下降。同樣，EM Grid（格柵）的準備過程、數據采集和數據等過程的優化也可以提高Cryo-EM的分辨率。隨著科學家的不懈努力，相信Cryo-EM技術會越來越強大，應用會越來越廣泛。

　　8.2Cryo-EM技術的未來

　　在短短的幾年內，令人振奮的Cryo-EM技術的進步推動了一個時代。今天，結構生物學家正在使用cryo-EM研究大型蛋白質復合物，大型細胞機器和病毒的結構和功能。技術的改進可能很快會產生更多小的膜蛋白結構。這些進步推動了人們的希望，未來的發展可能很快就會在“可以常規實現2 ?分辨率的黃金時代”即將來臨時出現【4】，并且甚至提高了期待——Cryo-EM快速而有效的預期將與許多應用競爭，甚至取代晶體學【2, 3】。

　　事實上，對于制藥行業的一些應用，Cryo-EM已經具有相當大的吸引力，因為它可能并不需要總是達到4 ?以下的分辨率；低分辨率結構對于更好地理解目標蛋白，以及位于蛋白質復合物的結構域或結合伴侶之間結合口袋的識別；藥物設計時也可能不總是需要準確確定化合物的結合模式。此外，盡管Cryo-EM結構的分辨率通常受蛋白質動態變化導致的構象多樣性限制，但由于重構各種中間狀態有助于理解SBDD，所以該限制可轉化為SBDD的優勢，并解釋一個復合體如何與其底物結合的機制。

　　為了利用這些機會，很多公司已經將更多的注意力集中在Cryo-EM上，使用各種方法來收集和處理EM數據，包括與學術實驗室合作（通過合作或收費服務）。雖然即將推出的類似于同步加速器的設備承諾滿足對Cryo-EM日益增長的需求，但存在諸多限制。在晶體學方面，晶體數據收集，結構解析與優化都非常迅速，使其成為需要多種結構小分子項目的極佳資源。在Cryo-EM中，每個數據采集跨越幾個小時或幾天的時間，使得cryo-EM的通量比晶體學小得多。但可以肯定的是，工業中使用Cryo-EM的速度正在迅速增加。因此，對于常規的藥物研發來說，仍需要開發一些工具，才能使Cryo-EM成為藥物獵手的首選方法----這需要投入強大的資金和耐心。

　　最后，在藥物研發中使用Cryo-EM不僅取決于Cryo-EM技術的的發展，還可能取決于晶體學的進一步發展。在今天，可以看到完善的、自動化的、快速的、易于量化的晶體結構篩選體系，因為這個領域已經發展了幾十年的時間。很難想象在接下來的幾年或幾十年中，Cryo-EM會發展成什么形式和速度，可以說，取代晶體學用于常規藥物發現也不是沒有可能。不過，可能更好的、更有可能的結果是：雖然選擇二者的界限已經開始轉向有利于Cryo-EM的方向，但似乎更有可能這兩種技術仍將作為藥物發現的方法、互相補充共同進步很長一段時間。

　　本文主要內容整理自參考文獻【1, 5, 6】，可能存在個別專業詞匯翻譯不夠準確的情況，敬請諒解！有興趣的讀者請查看原文。

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