Nature：從結構上揭示一種新型基因編輯復合物的作用機理

　　在一項新的研究中，來自美國哥倫比亞大學的研究人員捕捉到一種由對現有的基于CRISPR的工具進行改進而產生的新型基因編輯工具的首批結構圖片。他們在霍亂弧菌中發現一種獨特的“跳躍基因”并且這種跳躍基因可以在基因組中插入較大的基因負荷（genetic payload，即DNA序列）而不引入DNA斷裂，基于此，他們開發出這種稱為INTEGRATE的新型基因編輯工具。相關研究結果近期發表在Nature期刊上，論文標題為“Structural basis of DNA targeting by a transposon-encoded CRISPR–Cas system”。論文通訊作者為哥倫比亞大學瓦格洛斯內外科學院生物化學與分子生物物理學助理教授Samuel Sternberg博士和哥倫比亞哥倫比亞大學生物化學與分子生物物理學助理教授Israel Fernandez博士。

INTEGRATE復合物的結構顯示Cascade(深藍色)、TniQ(淡藍色)和向導RNA(紅色)，圖片來自Sternberg and Fernández Labs at Columbia University Irving Medical Center。

　　在這項新的研究中，這些研究人員利用低溫電鏡技術凍存正在發揮作用時的這種基因編輯復合物，從而揭示它的工作原理的高分辨率細節。

　　Sternberg說，“我們在我們之前的研究中展示了如何利用INTEGRATE在細菌細胞中進行靶DNA插入。這些新的圖片以令人難以置信的分子細節揭示這種基因編輯復合物的生物學機制，這有助于我們進一步改進這種基因編輯系統。”

　　開始時與CRISPR一樣，但是結局不同

　　這些研究人員使用了一種稱為低溫電鏡的技術，該技術涉及在液氮中快速冷凍這種基因編輯復合物樣品，然后用電子轟擊它。他們隨后使用在電子顯微鏡下捕獲的圖片產生這種INTEGRATE系統的原子分辨率結構模型。

　　這種結構模型揭示這種基因編輯復合物由兩個主要部分組成，這兩個主要部分排列成螺旋絲狀結構。在這兩個主要部分中，較大的部分稱為Cascade，纏繞并攜帶向導RNA（gRNA），用于掃描細胞中匹配的DNA序列。一旦Cascade定位并結合了靶序列，它將使DNA鏈穿過位于這種基因編輯復合物末端的TniQ“轉座”蛋白，并招募其他有助于修飾靶DNA序列的酶。

　　INTEGRATE的這種掃描機制似乎與其他經過充分研究的CRISPR系統的工作方式相似，其中的一些CRISPR系統也含有帶有gRNA的Cascade復合物。但是，與其他使用Cascade靶向DNA進行切割的CRISPR系統不同的是，INTEGRATE中Cascade的功能是靶向DNA以便基因負載的高精度插入。

　　在之前的研究中，Sternberg及其同事們通過使用遺傳學和生物化學提出這種CRISPR分子機器如何在功能上與轉座復合物---負責基因“跳躍”的分子---存在關聯，這項新的研究證實他們提出的這種觀點是正確的。

　　為何重要？

　　如今，世界各地的許多科學家們都在使用CRISPR-Cas9來快速低成本地對細胞基因組進行精確修飾。但是，CRISPR的大多數用途涉及切割靶DNA的兩條鏈，然后必須通過宿主細胞自身的分子機器修復DNA斷裂。控制這種修復過程仍然是這個領域中的主要挑戰，并且不想要的基因編輯常常被無意間引入了基因組中。此外，現有工具在精確地插入較大的基因負荷方面通常表現不佳。提高基因編輯的準確性是人們的當務之急，這對于確保使用這種技術開發的療法的安全性至關重要。

　　這種由Sternberg實驗室開發的新型INTEGRATE系統可以準確地插入較大的DNA序列，而無需依靠細胞的分子機器來修復斷裂的DNA鏈。因此，相比于目前廣泛使用的原始CRISPR-Cas系統，INTEGRATE被證明是一種更準確、更有效的基因修飾方法。這種新工具還可以幫助科學家們在DNA修復活性有限的細胞類型（比如神經元）中進行基因編輯。在神經元中，使用CRISPR進行基因編輯的嘗試相對而言不太成功。

　　下一步是什么

　　除了為未來的蛋白質工程提供信息之外，這些新結構突出了一個可能的校對檢查點。現有的CRISPR技術經常出現所謂的“脫靶效應”，即不加區分地對非靶序列進行修飾。這些新結構揭示了Cascade和TniQ如何協同工作，從而確保僅將DNA片段插入到正確的 “在靶（on-target）”序列中。這些研究人員計劃在開發用于疾病的新治療方法的工具時進一步探究這個檢查點。