NatureBiotechnology：北大陳良怡提升熒光顯微鏡兩倍分辨率

　　2014年諾貝爾化學獎授予了熒光超分辨顯微技術，利用熒光分子的化學開關特性（PALM/FPALM/STORM）或者物理的直接受激輻射現象（STED），實現超越衍射極限的超分辨成像。盡管如此，活細胞中的超分辨率成像仍然存在兩個主要瓶頸：

　　（1）超分辨率的光毒性限制了觀察活細胞中精細生理過程；（2）受限于熒光分子單位時間內發出的光子數，時間和空間分辨率不可兼得。

　　受限于這個瓶頸，為了在活細胞上達到60nm空間分辨率極限，現有超分辨率成像手段需要強照明功率（kW~MW/mm2）、特殊熒光探針和長曝光時間（>2 s）。強照明功率引起的強漂白會破壞真實熒光結構的完整性，長曝光時間在圖像重構時導致運動偽影，降低有效分辨率。迄今為止，基于光學硬件或者熒光探針的改進無法進一步提升活細胞超分辨率的時空分辨率，實現毫秒尺度60nm的時空分辨率成像。

　　2021年11月16日，北京大學未來技術學院陳良怡教授團隊與哈爾濱工業大學儀器科學與工程學院李浩宇教授團隊合作，在Nature Biotechnology（2020年IF54.908）上發表論文“Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy”。他們另辟蹊徑，發明基于新計算原理的熒光超分辨率顯微成像，進一步拓展熒光顯微鏡的分辨率極限。通過提出“熒光圖像的分辨率提高等價于圖像的相對稀疏性增加”這個通用先驗知識，結合之前提出的信號空時連續性先驗知識，他們發明了兩步迭代解卷積算法，即稀疏解卷積（Sparse deconvolution）方法，突破現有熒光顯微系統的光學硬件限制，首次實現通用計算熒光超分辨率成像。結合自主研發的超分辨率結構光（SIM）系統，實現目前活細胞光學成像中最高空間分辨率（60nm）下，速度最快（564Hz）、成像時間最長（1小時以上）的超分辨成像。結合商業的轉盤共聚焦結構光顯微鏡，實現四色、三維、長時間的活細胞超分辨成像。

　　1.應用舉例：Sparse-SIM超快活細胞成像揭示核孔結構和胰島素囊泡早期融合孔道

　　在活細胞成像中，稀疏結構光顯微鏡（Sparse-SIM）可以解析標記不同核孔蛋白（Nup35、 Nup93、Nup98或Nup107）的環狀核孔結構，而它們在傳統結構光顯微鏡（2D-SIM）下形狀大小與100nm熒光珠類似（圖1c，2d）。由于相機像素尺寸與孔徑直徑類似，測量的核孔擬合直徑與Sparse-SIM的分辨率相當。校正后Nup35和Nup107孔的直徑分別為~66±3 nm和~97±5 nm，而Nup98和Nup93直徑大小處于這個范圍中（圖1e，1f），結果與以前用其他超分辨成像方法在固定細胞中獲得的直徑相符。有趣的是，12分鐘超分辨成像可以顯示活細胞中核孔形狀變化，這可能反映了核膜上的單個核孔復合物動態重新定向到焦平面或遠離焦平面（圖1g），這是其他超分辨方法難以觀察到的。

圖1 Sparse-SIM解析核孔蛋白動態過程。（c）用Sparse-SIM觀察活COS-7細胞中以Nup98-GFP標記的動態環狀核孔的典型例子，持續時間超過10分鐘。上下區域分別顯示2D-SIM和Sparse-SIM下的圖像。（d）比較（c）中青色框中的核孔結構快照與100 nm熒光珠在不同重建方法（2D-SIM、20次RL解卷積后、50次RL解卷積后、Sparse-SIM）下的結果。（e）矯正后得Nup35-GFP（紅色）、Nup98-GFP（黃色）、Nup93-GFP（綠色）和Nup107-GFP（青色）標記的核孔結構的實際直徑（詳情請見文章）。（f）Nup35（66±3nm, n=30）、Nup98（75±6nm，n=40）、Nup93（79±4nm，n=40）、Nup107（97±5nm，n=40）的平均直徑環。左右兩幅蒙太奇分別為傳統Wiener重構或稀疏解卷積后的結果。（g）在6個時間點對（c）中的品紅色方框放大并顯示。比例尺：（c）500nm；（d，g，f）100nm。

　　通過滾動重建，Sparse-SIM的時間分辨率可達564Hz，識別出來INS-1細胞中VAMP2-pHluorin標記的、更小的胰島素囊泡融合孔道（如~61nm孔徑，圖2o，2p）。它們在囊泡融合的早期出現，孔徑小（平均直徑~87nm），持續時間短（9.5ms），不能被之前傳統的TIRF-SIM所識別。另一方面，鑒別出來的穩定融合孔在囊泡融合的后期出現，孔徑大（平均直徑~116nm），持續時間長（47ms）（圖2q），是之前看到的結構。值得一提的是，雖然這里發現的囊泡早期融合孔狀態很難被其他的超分辨率成像手段所直接驗證，但是它們的發生頻率與30多年前用快速冷凍蝕刻電子顯微鏡所觀察到的“小的融合孔發生概率遠低于大的融合孔”現象相吻合。

圖2 Sparse-SIM解析超快胰島素代謝過程。（n）不同種類囊泡的平均直徑。（o）囊泡融合事件的代表性蒙太奇圖像。（p）TIRF-SIM（上）和Sparse-SIM（下）記錄的囊泡分泌Kymograph圖。（q）早期（黃色）和穩定（綠色）融合孔的平均打開時間（左）、直徑（中）和持續時間（右）。比例尺：【a，e，m（top）】5μm；（b，j）500nm；【h，m （bottom）】1μm；（k）100nm。

　　2.應用舉例：稀疏解卷積是提升熒光顯微鏡分辨率的通用方法

　　與當下熱門的深度學習超分辨率顯微重建不同，信號的空時連續性、高空間分辨率導致的熒光圖像相對稀疏性這兩個先驗知識，是熒光顯微成像的通用先驗知識，不依賴于樣本的形態以及特定的熒光顯微鏡種類。因此，稀疏解卷積是通用熒光顯微計算超分辨率成像算法，可被廣泛應用于提升其他熒光顯微模態分辨率，觀察不同種類細胞器的精細結構及動態。

　　比如稀疏解卷積增強的商業超分辨轉盤共焦結構光顯微鏡（SD-SIM），可以實現XY方向90納米，Z方向250納米的空間分辨率，清晰記錄分裂期7μm深度內的全細胞內所有線粒體外膜網絡（圖3）。同樣，若稀疏解卷積增強與商業SD-SIM結合，可以很容易實現活細胞上的三維、四色超分辨率成像。稀疏解卷積可以與膨脹顯微鏡結合，解析細胞膨脹后的復雜結構；也可以與寬場、點掃描的共聚焦、受激輻射損耗顯微鏡以及微型化雙光子顯微鏡結合，實現近兩倍的空間分辨率提升。因此，稀疏解卷積的提出，將幫助使用各種各樣熒光顯微鏡的生物醫學研究者更好地分辨細胞中的精細動態結構。

圖3 Sparse SD-SIM解析活細胞三維線粒體外膜網絡。（k）活體COS-7細胞的線粒體外膜（Tom20-mCherry標記）的三維分布，顏色表征深度。（l）SD-SIM原始數據與Sparse SD-SIM的水平（左）和垂直（右）的白色框區域放大展示。比例尺：（k）5μm；（l）1μm。

　　總之，通過稀疏解卷積算法（Sparse deconvolution）來實現計算熒光超分辨率成像，與目前基于特定物理原理或者特殊熒光探針的超分辨率方法都不相同。與超快結構光超分辨顯微鏡結合形成的Sparse-SIM是目前活細胞光學成像中，分辨率最高（60納米）、速度最快（564幀/秒）、成像時間最長（1小時以上）的超分辨光學顯微成像手段。它也可以與現有的多數商業熒光顯微鏡結合，有效提升它們的空間分辨率，看到更清楚的精細結構動態。

　　哈爾濱工業大學博士生趙唯淞、北京大學博士后趙士群、李柳菊為共同第一作者，李浩宇和陳良怡為論文共同通訊作者，共同作者還包括哈爾濱工業大學譚久彬院士、劉儉教授，北京大學毛珩博士、生科院成像平臺單春燕博士和華南師范大學劉彥梅教授。參與合作的實驗室包括武漢大學宋保亮教授、北京大學陳興教授、中科院國家納米科學中心丁寶全教授和生物物理所紀偉教授等。該項工作受到國家自然科學基金委重大研究計劃、杰出青年基金，科技部重點研發專項，中國科協青年托舉工程，黑龍江省自然科學基金優青，北京市科委、北京市自然基金委和北京大學博雅博士后計劃等項目資助，得到北京大學膜生物學重點實驗室、麥戈文腦研究所、北大-清華生命科學聯合中心、北京智源人工智能研究院的支持，也是多模態跨尺度國家生物醫學成像設施建設過程中的重要成果。