NatureGenetics：全基因組測序領域的開拓性進展

　　當我們提到DNA的甲基化，通常是指胞嘧啶(C)碳環上5號碳原子的甲基化，5-甲基胞嘧啶(5mC)。實際上，在原核生物中存在著3種DNA甲基化型式，5mC、4mC（4-甲基胞嘧啶）和6mA（6-甲基腺嘌呤），6mA起主導作用，缺乏6mA可導致一些細菌的死亡。科學家們曾經以為具有重要生理功能的DNA 6mA修飾在生命的進化過程中，不可思議地從高等生物基因組中消失了。Nature重大發現改寫表觀遺傳理論

　　為了檢驗真核生物基因組中是否存在DNA 6mA修飾，更高靈敏度的檢測方法和設備應運而出。然而，由于檢測技術手段限制，科學界在低等單細胞真核生物、植物和動物基因組內檢測到低水平的6mA后，便猜測它可能是一個非典型的DNA堿基修飾型式。雖然有報道指出，與5mC的基因抑制作用不同，6mA似乎能啟動某些基因的激活。但總的來說，有關6mA與真核生物基因組功能的研究基本還是一片空白。如今，高靈敏度的單分子實時測序（Single-Molecule Sequencing in Real Time，SMRT）技術不僅為科研人員提供了高質量的基因組組裝，同時還能精準地譜寫表觀遺傳學圖譜。5月8日《Nature Genetics》刊登了一篇有關SMRT技術在6mA表觀遺傳學功能分析方面的最新進展。

　　大部分已被人類研究過的真菌只屬于兩個門：子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）。其他6個種群被歸類為“早期分化系（early diverging lineages）”，它們是真菌家族里最早的分支，探索這些原始真菌的基因產物對人類來說極有價值。真菌可以降解幾乎所有的天然聚合物，甚至一些人為化工產品，美國能源部門的任務之一便是從真菌中開發生物能源和環保資源。

　　“總的來說，與其他真菌成員相比，人們對早期分化系的了解相對貧乏。但是人們逐漸發現，這些品種卻有著豐富的重要用途。”本文的一作DOE JGI分析師Stephen Mondo說。“例如Neocallimastigomycetes，它是目前已知的具有最強降解能力的真菌，它擁有著如軍火庫般的植物細胞壁降解酶系統，這項能力可被用于生物能源的生產。”

　　美國能源合作基因組研究部（DOE JGI）的大規模的測序結果顯示，6mA修飾普遍存在于早期真菌種屬。研究人員采用PacBio單分子長片段測序平臺（型號：PacBio SMRT Analysis 2.3.0）對16種不同真菌進行基因組測序時，觀察到在早期分化的真菌基因組中，高達2.8％的腺嘌呤發生了甲基化，遠高于有報道的其他真核生物的6mA比例（此前6mA修飾記錄的保持者是一種水藻，僅有0.4%的腺嘌呤含有甲基化標簽）。

　　之前的研究發現真菌5mC一般對稱地出現在反義DNA鏈的回文CpG島（胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸密集區域）。本研究發現，早期分化系真菌的6mA是以對稱的方式，出現在ApT（腺嘌呤-胸腺嘧啶）富集區。6mA在兩股DNA鏈上保持同步出現，可能是為了細胞分裂中的甲基化傳遞。

　　在雙核菌亞界真菌的基因組中并未發現6mA的這種分布規律，而是散亂的非簇排列。相反，早期分化系真菌的6mA標記有80-99.6%都出現在 “甲基腺嘌呤集群(methylated adenine clusters, MACs)”。

　　研究團隊發現，5mC和6mA還存在著負相關性。具體來說，當5mC出現在基因組的重復區域時，MACs便會出現在啟動子上。這暗示了作為真核生物中基因表達相關的表觀遺傳標記，6mA可能具有獨特的作用。

　　“這次的研究是我們首次在真核生物基因組內直接對5mC和6mA進行比較分析，并且也是首個真菌6mA分析研究，”本文通訊作者、DOE JGI真菌基因組研究學術帶頭人Igor Grigoriev說。“在有機體內6mA的功能十分多樣，在動物中它參與轉座子活性的抑制作用，在藻類中它促進基因的表達。我們的分析表明，6mA與基因表達相關，并且甲基標簽根據基因功能選擇性地沉淀于功能和節能相關的基因上，這表示6mA是重要功能相關基因的生物標簽。”

　　“根據基因組學數據，我們列出了具有多樣化開發潛力的基因、酶和基于生物經濟和生物能源應用的代謝途徑目錄，”Grigoriev說。“大量的有用編碼基因中，絕大多數基因都含有6mA MACs。這項發現將有助于科研界更好地了解經濟價值基因的調控方式。”

　　“1000個真菌基因組”項目的目標是：每科真菌中，至少獲得1個代表種的參考全基因組序列。這篇《Nature Genetics》文章中的許多基因組都隸屬于1000個真菌基因組項目。使用Pacific Biosciences測序平臺，研究小組高質地完成了基因組組裝，并利用該測序平臺額外挖掘了真菌的表觀遺傳學修飾后，研究人員還使用免疫沉淀法（ChIP-seq和6mA IP-seq）和質譜分析法（LC-MS）等方法對比驗證了SMRT-seq的新發現。

　　早期分支系真菌的表觀遺傳學檢測結果顯示，Illumina二代測序技術和質譜技術都與SMRT-seq達成一致。但是在6種雙核菌亞界真菌中，盡管這些基因組內的6mA含量本身較低，SMRT-seq的檢出率仍高于其他測序方法。原因有二，或是其他技術的靈敏度低于SMRT-seq，或是SMRT-seq技術的假陽性偏高。考慮到其他10種基因組測序結果的一致性，我們有理由相信，減少了PCR擴增環節，逐個分子的覆蓋式掃描將帶給我們更高廣的視野。