NatureMethods：單細胞TCR研究新進展

　　引言

　　今年三月份，來自英國的科學家Michael Stubbington博士和Tapio L?nnberg博士一起，基于Fluidigm公司C1 mRNA測序樣本及相應數據，開發出一套用于研究T細胞基因序列信息的開放型分析工具 ---TraCeR，同時結合T細胞亞群的轉錄組數據分析，從而進一步揭示在不同免疫反應中蘊含的更深層次的T細胞功能特異性。該研究成果發表在著名的《nature methods》雜志上。

　　研究背景及成果

　　當機體受到外源性入侵時，免疫系統會召集所有免疫細胞亞群通過產生免疫反應與病原體進行對抗。由于病原體存在著多種多樣的差異，因而相應產生的免疫反應和和每個階段內涉及的細胞類型也有所不同。T細胞受體中V(D)J基因區域的隨機重排，導致了T細胞種類的復雜多樣化；這種多樣化使T細胞在識別和殺傷特異外源性抗原時則更為快速、準確和有效。

　　目前對T細胞受體（TCR）的主要鑒別方法之一是對其α和β鏈進行測序。但是，若要進一步全面理解T細胞反應機理，還需對不同T細胞亞群內部和相互間的表型差異進行更精確的識別。傳統免疫學研究中基于群體細胞測序獲得的數據很難實現對細胞異質性和不同細胞亞群的特性分析，因此在單細胞水平進行免疫細胞表型分析越來越廣泛地被應用于免疫學研究中。

　　最近，EMBL-EBI和劍橋大學Wellcome Trust Sanger Institute的Stubbington博士和L?nnberg博士一起，利用Fluidigm公司C1單細胞mRNA Seq系統快速高通量制備單細胞全轉錄組序列樣本，通過進一步的測序獲取了大量單細胞TCR序列數據，并在此基礎上開發出了一套用于分析T細胞基因序列和表型的開放型分析軟件 ---TraCeR，用于研究不同T細胞克隆的轉錄情況和相互間關系，從而揭示更深層次的T細胞功能特異性。

　　TraCeR分析方法不但可以提取每個單細胞的TCR序列信息，還可以平行分析每個細胞的基因表達情況；研究人員對那些與不同免疫反應和疾病發生有密切關系的TCR序列進行了重組，通過這種方法對其中潛在的分子機制和細胞功能進行深入研究，發現TCR序列具備類似于二維碼結構的“溯源”能力，與TCR和細胞亞群的變異，以及揭示機體的健康和疾病狀態有著密切關系。利用這些信息有可能識別和靶向定位與致病性相關的T細胞亞群，為復合抗體、疫苗研發，腫瘤免疫治療，以及自身免疫系統疾病等研究提供了大量的有效數據信息。

　　單細胞TCR研究的價值及優勢

　　對于每一個生物，TCR序列都存在著廣泛的多樣性。“幾乎每一個細胞都有一個不同的序列，所以對單個細胞進行分析勢必成為一種強有力的研究方法。”Stubbingto解釋說，“不同于群體細胞分析，單細胞研究改變了我們的思考方式。這在免疫學研究中是至關重要的；它可以為我們解決那些未知的、備受關注的問題提供一種新的、更為有效的手段。”

　　“我相信單細胞分析的影響將是深遠的，而我們才僅僅看到一個開端。單細胞分析深入到每個單細胞內部，讓我可以了解它們的‘想法’和機理，帶給了我非常大的啟發。”TraCeR的研發者之一，長期從事T細胞研究的L?nnberg博士說。

　　“T細胞的活性和分化過程都是發生在單細胞水平上的。利用單細胞分析TCR序列的價值在于：針對每一個特定的反應，我們都可以找到與之相對應的確切的序列，而不僅僅是簡單地測量一段TCR基因片段的表達水平。而這是傳統方法下以群體細胞為依托的研究手段所不能實現的。”—— L?nnberg博士

　　Stubbington博士指出，雖然目前有一些利用單細胞鑒別TCR的方法已經發表了，但是這一新的檢測分析方法無需針對特定的TCR靶向序列進行測序；由于利用Fluidigm的C1平臺可以快速實現單細胞轉錄組全長測序樣本的制備，因此后續的測序結果都可以通過TraCeR進行分析；也就是說，當進行單個T細胞測序時，在原有實驗基礎上，可以在另一個維度上獲得額外的scRNA Seq數據。此外，他補充說：“通過對成千上萬個表達基因的檢測，還可以使研究人員充分的了解每一個細胞的轉錄狀態。”

　　這對單細胞測序方法的推廣和降低實驗成本至關重要。“利用TraCeR方法，甚至可以對之前已經獲得的T細胞測序結果進行TCR數據分析。”L?nnberg博士指出。

　　在臨床中的應用

　　TraCeR這一新的方法很有可能改變以往我們對T細胞基因表達和相關免疫反應的認知。其重要性在于在疾病的發生和治療過程中，T細胞作為細胞間相互作用的核心因素，起著不可替代的作用。

　　Stubbington和L?nnberg博士認為在不久的將來，針對不同疾病的患者及其不同狀態，基于單細胞檢測的方法將會被廣泛應用并將有望指導臨床治療和護理。例如：

　　? 那些具備特異性抗原的細胞可以與疫苗發生反應并產生相應的T細胞記憶。

　　? 在腫瘤、自身免疫、感染性疾病中有著重要意義：在單細胞水平深入研究淋巴細胞的異質性可以為人們提供大量未知的信息。

　　? 微量樣本研究：這一方法還能幫助科研人員對臨床樣本中很難獲取的微量或痕量細胞樣本如：罕見T細胞亞群，循環腫瘤細胞等進行研究，從而為不同患者制定更有針對性、更有效的個性化治療方案。

　　? L?nnberg博士還預測由衰老引起的T細胞多樣性的降低將受到更多的關注。

　　? 目前兩位科學家已經將TraCeR方法應用于輔助性T細胞在感染過程中的分化這一研究項目中。

　　發展前景

　　現有的TraCeR方法可對人和小鼠的TCR序列信息進行快速分析；而他們正在進一步開發適用于其他物種的分析模塊 —— 基于由C1獲得的單細胞全長轉錄組序列樣本的測序結果，對不同物種已知的TCR中V/J區域基因序列進行重組，構建一個人工合成基因組數據和分析模塊；同時他們還計劃在不久的將來將該方法拓展至B細胞的深入研究。

　　這一方法創新性地將Fluidigm C1單細胞自動制備系統，二代測序及新型測序數據分析工具完美的結合在一起，大大提高了單次實驗有效數據的產出率，為科學家們研究T細胞，深入揭示不同疾病階段中免疫反應的機制提供了新的思路。

　　為了使用戶能夠更加快速方便的獲取并使用這一新的方法進行TCR研究，Fluidigm公司最近也進一步優化了其在C1系統中的應用方案。用戶可在Fluidigm公司主頁的Script Hub板塊中下載標準的C1 mRNA seq實驗程序和TraCeR分析軟件，對TCR表型及相關基因表達進行深入分析。